黑曲霉基因组与柠檬酸生产菌种改造课件

黑曲霉基因组简介

和

柠檬酸菌种改造初步方案孙际宾

李寅

中国科学院工业生物技术研究所(筹)实例：基因组重测指导赖氨酸高产菌株构建Ohnishietal.2002比较基因组学3个点突变

野生型菌株：080g/l50h27h1.解密黑曲霉基因组

NickRead1991黑曲霉测序大事记2000.07.荷兰帝斯曼DSM公司启动了对其拥有的黑曲霉菌株CBS513.88的测序计划，采用BAC加shortgun法2001.12.测序完成，8倍覆盖率，～500contigs，34.5Mb，>1.3万基因大约同时，IntegratedGenomics完成对黑曲霉菌株ATCC9029测序，4X，～1万congtigs2006.美国能源部JGI完成对柠檬酸生产菌黑曲霉ATCC1015测序，8X2007.02.DSM及合作伙伴在NatureBiotechnology上发表论文，对黑曲霉基因组进行系统阐述，并公布序列同期，JGI也公布其序列2007.09.德国HZI孙际宾等在GenomeBiology杂志上发表论文，对其代谢网络进行比较分析，初步阐明黑曲霉累积柠檬酸的机理SFB578——从基因到产品德国研究基金会DFG特别研究领域项目www.sfb578.tu-bs.de

2001启动，现在刚开始第三期德国HZI/TUBraunschweig主要研究对象:黑曲霉Aspergillusniger和巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium

16-20个动态子项目

子项目：代谢和调控网络的生物信息学黑曲霉CBS513.88基因组曲霉属基因组2009Aspergillus(Emericella)nidulansAspergillusaculeatusAspergillusawamoriNBRC4314AspergilluscarbonariusITEM5010AspergilluscarbonariusITEM5010AspergillusclavatusNRRL1AspergillusflavusAspergillusflavusNRRL3357AspergillusflavusNRRL3357AspergillusfumigatusA1163(CEA10)AspergillusnidulansFGSCA26(biA1)AspergillusnigerCBS513.88AspergillusnigerATCC1015AspergillusnigerATCC9029AspergillusparasiticusAspergillusterreusATCC20542AspergillusterreusNIH2624Aspergillusterreus18个菌株已经被测序或正在进行测序GeneandpathwaysofproteinsecrectionNERVEPGEntryintoERProcessesinERProteinmisfoldingProteincomplexesinvolvedinproteintransport

VesicleformationanddockingERtoGolgiandintra-GolgitransportGolgiandpost-GolgiproteinsortingGlycosylationIncooperationwithB4andtheA.nigerannotationteam黑曲霉基因组测序和注释帝斯曼公司等26个研究机构合作全面的基因组注释33M碱基对14165基因初步代谢分析详尽的蛋白质分泌途径Peletal.(2007)

GenomesequencingandanalysisoftheversatilecellfactoryAspergillusnigerCBS513.88.NatureBiotechnology,25:221-231.重构黑曲霉基因组规模代谢网络重建黑曲霉代谢网络999ECnumbers2443生化反应2349代谢物8倍于文献报道数据柠檬酸产生相关代谢途径提出基因冗余作为有机酸过量生产的自然机制提出了多个代谢工程靶位点AOX和CSSunetal.

GenomeBiology,2007,8:R182为什么黑曲霉生产柠檬酸供氧至关重要？葡萄糖+2ADP+2NAD2丙酮酸+2ATP+2NADH丙酮酸+CoA+NAD乙酰CoA+NADH+CO2丙酮酸+ATP+CO2草酰乙酸+ADP乙酰CoA+草酰乙酸

柠檬酸+CoA葡萄糖+ADP+3NAD

柠檬酸+ATP+3NADHATPADP:生长，维持，穿膜运输，产热3H2O1.5O29ADP9ATP呼吸链AOX-alternativemitochondrialoxidoreductase

其他线粒体氧化还原酶

Citrateproduction:ATPandNADHexcessiveAOXCytochrome/electrontransferchainindependentcriticalroleinthecitricacidproductionKnockout/overexpressionoftheknowAOXhavenoeffectoncitrateproductionadditionalanduniqueAOXnowfoundinA.nigerstrains小结过量表达黑曲霉特异性的柠檬酸合成酶，可能会加快柠檬酸合成速度过量表达可能加强NADH的循环，从而消除瓶颈，加快柠檬酸产生速度 ……但是，并不能降低O2的消耗和热量的产生问题：如何将NADH循环而不消耗氧气和产生热量？2.柠檬酸生产菌株改造方案基因组测序作为分子改造基础阻断草酸合成加快柠檬酸合成速度高温柠檬酸发酵菌种超高速基因组排序技术illumina/Solexa每个机器排序周期（5天）产生>20GB数据相当于将黑曲霉测70次Roche454technology/FLX7.5小时将大肠杆菌排序20次材料费<1万欧元

ABI/SOLiD未来数年内：

人类基因组1000$

细菌基因组100$超高速、廉价Roche454technology比较野生型与生产菌株基因组，将鉴定更多的靶点拷贝数、新酶酶的表达调控酶的构象与活性调控大大加快分子生物学改造工作大大其他系统生物学手段的应用，阐明高产机理，大幅度改造菌种

长期目标转录组、蛋白质组、代谢组2.柠檬酸生产菌株改造方案基因组测序作为分子改造基础阻断草酸合成加快柠檬酸合成速度高温柠檬酸发酵菌种草酸合成途径草酰乙酸水解酶：草酰乙酸+水

草酸+乙酸exclusivelyproducedviaoxaloacetate(Kubiceketal.1988;Pedersenetal.2000a;Ruijteretal.1999)catalyzedbyoxaloacetatehydrolase(EC).Pedersenetal.2000b：克隆了该酶基因oah，并随后证明将该酶缺失，则完全阻断草酸合成(Pedersenetal.2000a).生物信息学分析表明黑曲霉有至少8个基因与oah有同源性，不排除发生微量副反应的可能性实验方案：敲除oah基因难点：考虑柠檬酸的食品应用，基因敲除菌株不能包含有外源DNA片段策略：两次敲除

野生型；第一次依靠同源重组将oah大部分以抗性标记+GFP蛋白替换，抗性为选择标记；

第二次同源重组将抗性基因和GFP以不完整的oah基因替换，选择标记为菌落颜色oah抗性GFPLRRLΔoah2.柠檬酸生产菌株改造方案基因组测序作为分子改造基础阻断草酸合成加快柠檬酸合成速度，缩短发酵周期高温柠檬酸发酵菌种Blackbox–graybox–whiteboxMediumpH,pO2,rpmproductsX-OMICS+Dynamics+Regulation方案：加快柠檬酸合成速度，缩短发酵周期

过量表达柠檬酸合成酶和第二个AOX将NADH导向有益的物质合成途径比较组学阐明机理，在野生型菌株基础上鉴定和整合更多突变计算生物学数据集成与分析;

全细胞网络模型化;理性代谢工程设计系统生物技术菌种改造流程系统代谢工程操作转录组蛋白组代谢组代谢流组Interactome?组基因组实验室小试及工艺优化中试放大、项目转让高通量组学，定量描述细胞生理野生型工业生产菌高通量筛选突变株不同来源菌株高通量筛选突变株发酵过程组学测定过程数据整合新型构建策略2.柠檬酸生产菌株改造方案基因组测序作为分子改造基础阻断草酸合成加快柠檬酸合成速度高温柠檬酸发酵菌种对“急需高温发酵菌株”的理解现有柠檬酸菌株在高温下可以生长但柠檬酸产生能力差由于发酵过程产生大量发酵热，必须连续移除才能控制发酵温度在合适水平（34度）由于冷却塔产生的冷却水与发酵温度差别较小、换热效率低，特别是在炎热的夏天，造成控温换热消耗的动力（能耗）大这部分能耗占发酵成本相当大的比例方案：解决移除发酵热的能耗问题控制发酵热产生的源头：不将NADH传递给氧，不产生过剩的热量对氧气需求减弱，节省供氧所需要的成本，包括简化反应器设计，降低搅拌能耗，降低空气压缩和预处理成本（可能产