转基因植物技术的鉴定课件

转基因植物技术的鉴定组员：魏翠芳、杨帆、甘小东、孙圆圆、

王翠华、张辉、曹盼、王凯、罗青帮田晓瑞、马小莉、王亚平、袁源转基因技术将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgenetechnology）。技术路线目的基因分离植物表达载体的构建受体材料的准备遗传转化转化组织组织脱分化转化植株筛选炼苗1.目的基因的分离（1）已知基因的获得①化学合成法②PCR扩增（2）未知基因的获得①构建基因组文库，筛选目的基因②构建cDNA文库，筛选目的基因③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因……①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①银杏叶RNA提取②反转录cDNA③chs全长cDNA的克隆④TA克隆及测序⑤向chs两端引入酶切位点⑥双酶切⑦定向克隆⑧导入农杆菌

2.植物表达载体的构建3.受体材料的准备细胞的全能性：分化细胞脱分化再分化

但进去的DNA片段整合效率极低，不易获得再生植株，可能发生共抑制现象.基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.转化效率较低，且仅限于能由原生质体再生出植株的植物。花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.表1几种植物转基因方法比较

转基因方法转化的优点转化的缺点DNA间接转化法农杆菌介导基因转移受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞DNA直接转化法（1）基因枪转化法（2）电击法（3）PEG介导基因转化法（4）花粉管通道法无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法）5.转化组织——农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化受体植物叶盘侵染共培养筛选培养诱导成苗预培养叶盘，或愈伤组织遗传转化主要的影响因素：1.预培养时间：一般0~3天，过长不利于侵染2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在0.2~1.0）3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆菌难以除净，毒害材料。4.共培养时间5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度(A)仅共培养基中加AS(B)仅菌液中加AS(C)菌液和共培养基中均加ASAS使用浓度：50μM~200μM实验结论：A与C效果最好且差异不明显6.炼苗7、转基因植物的鉴定个体水平鉴定个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导转化体表现其性状特征或生理特征。细胞和组织水平鉴定报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。1.绿色荧光蛋白（GFP）基因特点：可在荧光显微镜或流式细胞仪中直接观察基因的表达。2.氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因

缺点：信号没有NPT-II强优点：克服了受体细胞非特异性酶本底较高的缺点，且CAT酶定量分析很准确。3.β-葡萄糖酸苷酶（GUS）基因GUS基因所编码的β-葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的底物4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形酮，可用荧光光度计进行定量测定。其它报告基因荧光素酶（LUC）基因二氢叶酸还原酶（DHFR）基因抗除草剂Basta（bar）基因胭脂碱、章鱼碱基因新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）基因潮霉素磷酸转移酶（HPT）杂交鉴定

外源基因整合的Southern杂交鉴定

外源基因转录的Northern杂交检测

外源基因表达蛋白的检测

外源基因整合及表达的原位杂交检测Southern杂交过程8.转基因植物的应用植物基因改良

抗虫害植物、抗除草剂植物、高品质植物转基因植物生产药物转基因植物富含维他命A的黄金大米转基因棉花（Bt基因）抗虫玉米转基因番茄（抗花叶病基因）1983年美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜。1994年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市。1995年转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产。2000年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆。迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴、桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。应用于生产转基因药物的植物药物名称基因来源应用植物载体核糖体抑制蛋白恬楼、玉米抑制HIV烟草血管紧张肽转化酶牛奶抗过敏烟草、番茄抗体老鼠多种用途烟草抗原细菌、病毒病原口