第04章分析方法验证new课件

药品检验工作的基本程序取样鉴别检查含量测定写出检验报告1第四章药物定量分析与分析方法验证二.定量分析方法的特点三.药物分析方法的验证四.生物样品分析方法的基本要求一.定量分析样品的前处理方法2第一节定量分析样品的前处理方法一、概述含卤素药物C—X乙烯型卤和芳卤烯丙型卤和苄卤卤代烷型3三氯叔丁醇六氯对二甲苯泛影酸碘他拉酸第一节定量分析样品的前处理方法4第一节定量分析样品的前处理方法不经有机破坏经有机破坏直接测定配位滴定法氧化还原滴定法水解后测定碱水解酸水解经还原分解后测定湿法破坏——凯氏定氮法干法破坏高温灼烧法氧瓶燃烧法5(一)、直接测定法葡萄糖酸钙EDTA配位滴定富马酸亚铁邻二氮菲-硫酸铈滴定葡萄酸锑钠间接碘量法(二)、经水解后测定法适用范围：金属原子不直接于碳原子相连或某些C-M键结合不牢固的有机金属药物。6三、经有机破坏的分析方法含氮、硫、硫柳汞、氯化钠的生物制品、含氮有机合成药物测定的前处理和生物制品中金属元素测定时生物基质的去除。H2SO4-HNO3H2SO4-HClO4H2SO4-H2SO4HNO3-KMnO4分解剂/消化剂辅助分解剂——凯氏定氮法测定含有氨基和酰胺结构的药物结构(一)湿法破坏9凯氏烧瓶K2SO4(提高消解温度)CuSO4(加快消解速度)硫酸碱液硼酸(吸收液)甲基红-溴甲酚绿指示剂硫酸滴定空白校正10(二)干法破坏1.高温灼烧法用于含卤素、含磷药物和药物中砷盐的检查。常加入无水碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化。2.氧瓶燃烧法系指将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使有机结构部分彻底分解为CO2和H2O，待测元素根据电负性的不同转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，再根据其性质和存在方式选择方法进行分析。11第一节定量分析样品的前处理方法1213一、容量分析方法1.滴定度每1ml规定浓度的滴定液所相当的被测药物浓度。被测药物滴定液第二节定量分析方法的特点1415第二节定量分析方法的特点二、光谱分析法(一)紫外-可见分光光度法仪器校正空白溶剂校正吸收峰波长确定A－(0.3~0.7)16第二节定量分析方法的特点含量测定方法1.对照品比较法原料药172.吸收系数法习题一维生素B2含量测定取本品75mg，精密称定，置烧杯中，加冰醋酸1ml与水75ml，加热溶解后，加水稀释，放冷，移置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，混匀；精密量取10ml，置100ml量瓶中，加1.4%醋酸钠溶液7ml，并用水稀释至刻度，摇匀，照分光光度法在444nm的波长处测吸收度，按维生素B2的吸收系数为323计算第二节定量分析方法的特点18第二节定量分析方法的特点3.计算分光光度法4.比色法19特点：灵敏度高，可达10-10～10-12g/ml要求低浓度下测定须做空白测定荧光弱的药物可衍生化后测定(二)荧光分析法20(三)色谱分析法1.HPLC示例一炔诺酮的含量测定照高效液相色谱法(附录ⅤD测定)色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(65:35)为流动相，检测波长为244nm。理论塔板数按炔诺酮峰计算不低于1500，炔诺酮峰与内标物质峰的分离度及主成分峰后一杂质峰与主成分峰的分离度均应符合要求。21第二节定量分析方法的特点测定法

取本品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取此溶液2ml与内标溶液3ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱仪，记录色谱图；另取炔诺酮对照品适量，精密称定，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。22定量分析的方法(外标法)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)23定量分析的方法(内标法)0.20.61.01.41.82.22.63.0Time,min0%50%100%Rel.Int.(%)24第二节定量分析方法的特点测定法

取本品约35mg，精密称定，置10ml棕色量瓶中，精密加入内标溶液2ml，用石油醚(30～60°C)溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取1μl注入气相色谱仪，测定，即得。本品含α-蒎烯(C10H16)不得少于70%。25第三节药品分析方法的验证目的：

证明所采用的分析方法适合于相应的检测要求效能指标：评价分析方法的尺度

效能指标包括:

精密度,准确度,检测限,定量限,选择性,线性与范围,耐用性26一、准确度（accuracy）

系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。(一)含量测定方法回收率(Recovery)回收试验加样回收试验3×3，至少9个测定结果27二、精密度(Precision)

系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之接近的程度。表示：偏差(d)、标准偏差(s),、相对标准偏差(RSD)重复性:

同一实验室,同一人多次测定的精密度中间精密度:

同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度

重现性:

不同实验室，不同人测定的精密度28三、专属性(Specificity)指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。目视法信噪比法S/N=3四、检测限(LimitofDetection,LOD)药物能被检出的最低浓度(µg/ml)五、定量限(LimitofQuantitation,LOQ)药物能被定量测定的最低浓度(µg/ml)信噪比法S/N=1029影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等六、线性与范围(LinearityAndRange)待测结果(响应值)与试样中被测物的浓度或量直接成正比关系的程度。

Y=a+bx

（r=0.9999)七、耐用性(Robustness)测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度30①①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充②③视具体情况予以验证③31第三节药品分析方法的验证各种含量测定方法对效能指标的要求1.容量分析法用原料药精制品(含量>99.5%)或对照品考察方法的精密度，RSD≤

0.2%

；回收率一般在99.7～100.3%之间。

2.UV法用适当浓度的精制品进行测定，其RSD≤1%

。制剂的测定，回收率一般应在98～102％之间。3.HPLC法要求RSD<2％，回收率98～102%之间。32第四节生物制品分析方法的基本要求一、常用样品的种类、采集和贮藏(一)血样

①血浆(plasma)②血清(serum)③全血(二)唾液(三)尿液

用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度，药物代谢物及其代谢途径、类型、速率等的研究；临床上用于判断患者是否违反医嘱用药。33二、生物样品分析前处理技术全血/血浆，组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取RIA残渣化学衍生化(提取烃基化)碱回提酸回提HPLCUV、FLD、ECDTLC分光光度法UV、FLDGCFIDECDN/P-FIDGC-MS34蛋白质的去除加入与水混融的有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃)加入中性盐(饱和硫酸铵、硫酸钠、枸橼酸盐)加入强酸(三氯醋酸、高氯酸、偏磷酸)加入金属沉淀剂(CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH)缀合物的水解酸水解(盐酸)酶水解(葡糖酸苷酶、硫酸酯酶、枯草菌溶素)有机破坏(硝酸-高氯酸消化)分离、纯化与浓集液-液萃取法

(Liquid-LiquidExtraction,LLE)液-固萃取法

(Liquid-SolidExtraction,LSE)第四节生物制品分析方法的基本要求353637用有机溶剂(甲醇)冲洗——洗净用水冲洗——活化上样用水或缓冲液冲洗，洗去内源性物质有机溶剂洗脱药物收集洗脱液······3839三、定量分析方法的验证药典附录《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》国家食品药品监督管理局新药评审中心《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》

《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》40第四节生物制品分析方法的基本要求(一)、特异性

所测的物质是原型药物或特定的活性代谢物，内源性物质和响应的其他代谢物及其他药物不影响样品的测定。空白血浆空白血浆＋标准物质受试血浆41(二)、标准曲线与线性范围6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶碱(µg/