SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用

SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用摘要生物大分子的活性是通过不同分子或相同分子之间的相互作用来实现其生物学功能。在结构生物学研究领域中，单纯解析生物大分子的结构已不能满足现代科研的基本要求，所以研究其生物学功能受到了越来越多的重视。本文主要介绍现在常用的SPR技术和ITC技术以及它们在结构生物学中的应用。关键词SPR技术ITC技术结构生物学前言结构生物学是前个世纪后半叶才蓬勃发展起来的重要学科，通过研究核酸、蛋白质等生物大分子的空间结构，可以为生物大分子发挥生理功能的机理提供关键解释[1]。生物分子之间的相互作用奠定了生物生命现象的基础，因此研究生物分子之间的相互作用可以在分子水平上更加精细地阐述生物反应发生的机理，揭示生命现象的本质[2]。关于蛋白质相互作用的检测手段已有很多，但是其缺点也很明显。SPR（表面等离子共振）生物传感技术作为一种新兴的光学生物化学检测技术，与传统的生化分析方法相比，具有无需标记、灵敏准确、快速、能够实现在线连续检测等优点[3]。此外，在生物体中的各种生物分子之间的相互作用并不像化学反应那样剧烈。通过热力学研究，它能够在结合机制的阐明中起重要作用，为药物的设计提供合理的理论模型[4]。为了研究分子间弱的相互作用力，ITC（等温滴定量热分析）技术便应运而生，它在生物热力学模型的建立、蛋白质和配体的结合以及表面活性剂和聚合物的相互作用中都扮演了关键角色[5]。SPR技术SPR（表面等离子共振）是指在光波的作用下，在金属和电介质的交界面上形成的改变光波传输的谐振波[6]。在介质（一般为玻璃）表面涂上一层金属薄膜（一般为金属），入射光在界面处发生全内反射时，产生的消逝波渗透到金属薄膜内，可以激发金属表面等离子体使之产生等离子波。当入射光的入射角和波长在某一适当值时，表面等离子波与消逝波的频率和波数相等，此时两者将发生共振，入射光能量被吸收，反射光强大幅度减弱，可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此为共振峰，对应的入射角为SPR角[2]。SPR角随金属表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又与金属表面结合的分子的质量成正比。当目标分子结合到传感器表面时（图1），能够引起SPR角度的变化，我们可以通过检测谐振角、谐振波长或谐振强度的变化来反应生物分子之间的相互作用[7]。图1光学无标记生物传感器插图[7]SPR的实验方法：将需要检测的分子键合到生物传感器的芯片上（该步骤可以委托公司完成），然后将蛋白分子溶液以恒定的流速流过芯片表面。如果检测的分子能够与与蛋白分子相互作用，那么生物传感器表面的质量便会增加，改变传感器表面折射率，从而使共振角度发生改变。折射率每变化1000RU，那么表示芯片表面每平方毫米有1纳克的质量发生改变[8]。现在实验室广泛使用的表面等离子共振传感器有Biacore系列，它们的光学检测部件一般包括光源、TM波偏振器、棱镜、检测芯片、信号检测器这六个大的部分（图2）。光源发出的光经过透镜后，能产生平行的光束，透过棱镜，再检测芯片上质量的改变情况，最后的反射光经过各级的检测器、放大器进行处理，在记录仪上显示其变化情况。通过系统自带的计算软件，计算反应的平衡常数、解离常数。图2光学SPR传感系统[6]SPR在结构生物学中的应用SPR技术在生命科学领域都有着广泛的应用，比如药物代谢分析，生物检测，免疫检测、蛋白质功能分析等。下面，主要介绍一下SPR在结构生物学上的最新应用和成果。到影响。AndrasiM等[17]使用各种不同的方法研究抗人白蛋白单克隆抗体和其抗原蛋白之间的相互作用，实验表明由ITC获得的解离常数数值与使用ACE(一种研究分子结合的方法)获得的值是一致的。BrathU等[18]在研究钙调蛋白中与麻醉剂七氟醚的结合位点时，使用了ITC去测量它们之间的亲和力。实验表明，七氟醚在同与钙离子结合的钙调蛋白作用时，有低的亲和力，然而当缺乏钙离子时，它们之间没有相互作用。除此之外，ITC还用在其他许多研究领域。比如冯雪等[19]采用等温滴定量热法考察了益气复脉冻干干粉针与VC注射液及5%的葡萄糖注射液之间的相容性。实验结果表明，根据产生了的能量变化大小，益气复脉冻干干粉与VC注射液的反应属于化学反应范畴，而益气复脉冻干干粉与葡萄糖注射液的反应属于扩散引起的物理变化。讨论与展望以上两种实验研究方法因其优越性已经越来越多地用于结构生物学的研究之中，但是，以上两种方法也有各自的问题需要解决。SPR技术待测的分子只局限于大分子，小分子会对其造成严重的误差；对于金属芯片的要求也比较严格；不能消除非特异性结合带来的影响。ITC技术很少能够与其他仪器联合，缺乏特异性，对样品组成要求很高。两种技术共有的问题是这两种仪器都很昂贵，成本较高。以上这些缺点都限制了它们的发展。我们有理由相信，在今后的研究中，随着这这两种技术越来越完善，它们的应用必将得到更多的发展，其前景也会越来越广阔。参考文献[1]王宏伟.冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望[J].中国科学:生命科学,2014,10:1020-1028[2]孙小婷,靳岚,凌沛学.表面等离子共振和等温滴定量热技术及其在蛋白质相互作用中的应用[J].药物生物技术,2012,06:540-545[3]孟庆石,劳文燕,潘映红.表面等离子共振生物传感器技术及在生命研究中的应用[J].生命科学仪器,2009,01:10-13[4]PerozzoR,FolkersG,ScapozzaL.Thermodynamicsofprotein-ligandinteractions:history,presence,andfutureaspects[J].JReceptSignalTransductRes,2004,24(1-2):1-52[5]娄朋晓,王玉洁,白光月,等.表面活性剂分子间弱相互作用的直接能量表征——高灵敏等温滴定量热法[J].ActaPhys.Chim.Sin,2013,29[6]符运良,傅军,吴英才,袁一方.表面等离子共振传感技术的发展与应用[J].激光杂志,2006,06:15-17[7]XudongFan,IanM.White,SiykaI.Shopova,HongyingZhu,JonathanD.Suter,YuzeSun,Sensitiveopticalbiosensorsforunlabeledtargets:Areview,AnalyticaChimicaActa,Volume620,Issues1–2,14July2008,Pages8-26,ISSN0003-2670[8]GulnaraSafina,Applicationofsurfaceplasmonresonanceforthedetectionofcarbohydrates,glycoconjugates,andmeasurementofthecarbohydrate-specificinteractions:Acomparisonwithconventionalanalyticaltechniques.Acriticalreview,AnalyticaChimicaActa,Volume712,27January2012,Pages9-29,ISSN0003-2670[9]JustinC.Deme,MarkA.Hancock,JamesW.Coulton,etc.PurificationandinteractionanalysesoftwohumanlysosomalvitaminB12transporters:LMBD1andABCD4[J].MolMembrboil.2014Nov,31(7-8):250-261[10]J.P.Landry,YaohuangKe,Guo-LiangYu,X.D.Zhu,Measuringaffinityconstantsof1450monoclonalantibodiestopeptidetargetswithamicroarray-basedlabel-freeassayplatform,JournalofImmunologicalMethods,Availableonline20December2014,ISSN0022-1759[11]HuangY,ZhangY,ZhaoB,XuQ,ZhouX,SongH,YuM,MoW.StructuralbasisofRGD-hirudinbindingtothrombin:Tyr3andfiveC-terminalresiduesarecrucialforinhibitingthrombinactivity[J].BMCStructBiol,2014Dec20,14(1):26[12]宋熙熙,邵爽,雷群芳,等.等温滴定量热法测定脲酶催化尿素水解反应动力学[J].浙江大学学报:理学版,2009,36(2):175-179[13]GhaiR,FalconerRJ,CollinsBM.Applicationsofisothermaltitrationcalorimetryinpureandappliedresearch—surveyoftheliteraturefrom2010[J].JournalofMolecularRecognition,2012,25(1):32-52[14]王雪松,杜为红,王保怀.淀粉样蛋白聚集纤维化的抑制作用研究[J].中国科学:化学,2014,06:822-830[15]杨少梅,侯瑾,黄志宁等.紫杉醇与人血清白蛋白的相互作用[J].厦门大学学报（自然科学版）,2014,53(4):581-587[16]杨炳君.碲化镉量子点对原代肝、肾细胞及氧化应激蛋白质的毒性研究[D].山东大学,2014[17]AndrasiM,LehoczkiG,NaqyZ,GasparA.Acomparativestudyofcapillaryelectrophoresisand

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