医学分子生物学

医学分子生物学名词解释：结构基因(structuralgenes)：可被转录形成mRNA，并转译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。ORF开放阅读框架（openreadingframe，ORF）：是指DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码为止的一个连续编码。C值(C-value)：一种生物体单倍体基因组DNA的总量，用以衡量基因组的大小。C值矛盾/C值悖论：C值和生物结构或组成的复杂性不一致的现象。基因组（genome）：是指生物体全套遗传信息，包括所有基因和基因间的区域重叠基因是指同一段DNA片段能够参与编码两种甚至两种以上的蛋白质分子。SNP单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism）是由基因组DNA上的单个碱基的变异引起的DNA序列多态性。是人群中个体差异最具代表性的DNA多态性，相当一部分还直接或间接与个体的表型差异、对疾病的易感性或抵抗能力、对药物的反应性等相关。SNP被认为是一种能稳定遗传的早期突变蛋白质组(proteomics):指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律.质谱技术massspectrometry,MS样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定分子量开放阅读框=ORF基因工程又称为重组DNA技术，是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术。限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板、4种dNTP为底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆转录作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依赖DNA的DNA聚合酶作用。粘性末端被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（来自360问答）载体vector指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。载体的本质为DNA。多克隆位点载体上具有多个限制酶的单一切点（即在载体的其他部位无这些酶的相同切点）称为多克隆位点报告基因（reportergene）：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因。转化以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程称为转化（transformation）感受态细胞细胞膜结构改变、通透性增加并具有摄取外源DNA能力的细胞称谓感受态细胞(competentcell)。碱裂解法在NaOH提供的高pH（12.0～12.6）条件下，用强阳离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。核酸变性变性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，维系DNA分子二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA由双螺旋变成单链过程。核酸复性质粒（plasmid）是指细菌染色体以外的小分子环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。质粒克隆载体的主要用途：①用于保存和扩增<2Kb目的DNA。②构建cDNA文库。③目的DNA的测序。④作为核酸杂交时的探针来源。作为克隆载体的质粒应具备哪些特点？（来自360问答）用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：

①具有松驰型复制子（如ColE1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。

②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或多克隆位点），以便目的DNA片段插入。

③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。

④分子量相对较小和较高的拷贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可。简述分子克隆技术的基本步骤？一、目的基因的获取二、载体的选择三、目的基因和载体的酶切与连接四、重组DNA导入受体细胞五、重组体的筛选和鉴定简述蓝白斑筛选实验的原理？b-半乳糖苷酶基因失活筛选（蓝白斑筛选）：使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有b-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，宿主细胞携带编码b-半乳糖苷酶C端部分序列，虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形成具有活性的酶蛋白质-b-半乳糖苷酶，这种互补现象叫a互补，在生色物质X-gal和IPTG存在下形成蓝色菌落，但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体b-半乳糖苷基因读框，不能编码b-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。如何进行基因组DNA的提取、纯化和鉴定？生物样本预处理：粉碎组织、理解细胞，DNA释放、蛋白质沉淀降解。分离：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃缠绕法、异丙醇沉淀法。纯化：对基因组DNA粗品通过透析、层析、电泳（PAG、AGE、PFGE）、选择性沉淀等方法提取特定DNA片段，并通过柱层析、有机溶剂抽提等方法沉淀、洗涤、得到基因组DNA纯品。鉴定：浓度鉴定、纯度鉴定、完整性鉴定。简述寡核苷酸探针的设计原则？设计原则：探针长度：一般要求在10～50bpG／C含量为40％～60％探针分子中应避免互补序列避免同一碱基连续出现，一般不能多于4个，如GGGG-或-CCCC-5、借助计算机相应软件与已知的各种基因序列进行同源性比较理想的探针标记物应具有哪些特点？理想的探针标记物应具有以下特点检测物要灵敏、特异、稳定、简便标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm值标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉4、标记物对检测方法无干扰。核酸分子杂交的影响因素有哪些？1、探针的选择；2、探针的标记方法；3、探针的浓度；4、杂交反应温度；5、杂交反应时间；6、洗膜温度；7、杂交液。PCR的原理是什么？PCR体系需具备哪些要素？原理：1、PCR技术实际上是模拟体内DNA半保留复制过程，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，由变性－退火－延伸三个基本反应步骤构成。2、在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步,模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。PCR反应体系：模板（template）；引物（primer）；DNA聚合酶（DNApolymerase）；dNTP；PCRbuffer简述PCR技术的一般方案。1、50ulPCR反应体系的组成:样品DNA0.1～1ug；正链引物（25umol/L）1.0ul；负链引物（25umol/L）1.0ul；dNTP（各2.5mmol/L）4.0ul；10×PCR缓冲液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶1～2.5u；蒸馏的去离子水补至50ul。2、对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。3、PCR仪工作参数的设置：94℃30～60sec，55℃30～60sec，72℃30～60sec，循环30次，最后72℃延伸5min。4、PCR产物的保存：PCR产物于4℃保存。PCR引物的设计原则有哪些？长度15～30b，过短特异性降低，过长则成本增加，产量也下降。引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45～55%左右。3、引物内部不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构；两个引物之间尤其在3’末端不应有互补链存在，不然会形成引物二聚体。4、引物的碱基顺序与非扩增区域同源性小于70%或连续互补碱基少于8个。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。5、引物的3′末端与模板DNA一定要配对。另外3′末端的末位碱基最好选T、G、C，而不选A（引物3′末端碱基在错误配对时不同碱基的引发效率存在很大差异）。6、只要与模板DNA结合的引物长度足够，引物的5′末端碱基最多可以有10个碱基不与模板DNA匹配，并不影响PCR反应进行。TaqMan荧光定量PCR技术的原理是什么？1、PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，2、3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号；3、探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来；4、荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例。有哪些荧光定量PCR技术？请分别简述其要点。荧光染料法：SYBRgreen荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。荧光探针法1）Taqman技术：3’端的荧光Q分子吸收5’端荧光R分子的荧光信号；探针5’端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来；荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例。LightCycler探针技术：荧光淬灭的程度与起始模板数的量成正比3）molecularBeacon技术（分子灯塔法）工作原理：包括发夹形的寡聚核苷酸探针和内部淬灭的荧光团；分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭；单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交；探针5’和3’端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消