碱裂解法提取质粒课件

碱裂解法提取质粒DNA碱裂解法提取质粒

通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理及操作。一、实验目的碱裂解法提取质粒质粒(Plasmid)：质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链DNA分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。在细胞内它们常以共价闭环的超螺旋形式存在。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。二、实验原理碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，具有以下特点：

易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。

碱裂解法提取质粒二、实验原理高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放①染色体DNA断裂成不同长度的线性双链DNA；②线性双链DNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。①质粒DNA不发生断裂，保持双链闭合环状；②双链DNA并不完全分离。高酸中和至中性变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化RNA酶消化除去RNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质碱裂解法提取质粒SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。碱裂解法提取质粒三、主要试剂及作用溶液Ⅰ：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成(保护、缓冲)葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒(保护作用)EDTA

的作用是络合掉镁等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用（保护作用）Tris-HCl使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围（缓冲作用）8碱裂解法提取质粒

溶液II：由SDS（十二烷基硫酸钠）与NaOH组成(裂解、变性)SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性（裂解细胞和蛋白质变性作用）NaOH（PH>12）的作用是破坏氢键，使DNA分子变性（DNA变性作用）9碱裂解法提取质粒溶液III：HAc和KAc组成的高盐溶液(复性，分离)HAc溶液能中和溶液Ⅱ的碱性，使染色体DNA变性而发生缠绕，并使质粒DNA复性。KAc会与SDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的DNA也会与蛋白质-SDS复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNA分离。碱裂解法提取质粒四、试剂配制

溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0)。

1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，贮存于4℃。溶液Ⅱ：0.2NNaOH，1%SDS。2NNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。

3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。碱裂解法提取质粒4.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。5.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）7.5×TBE：Tris碱54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O4.65g，加ddH2O至1000ml。15lbf/in2高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。8.RNaseA（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNaseA的10mg/ml，TE配制，沸水加热15min，分装后贮存于-20℃。碱裂解法提取质粒实

验步骤加1.5ml培养物于EP管，12000g×30S

除去上清，加入冰的200µl溶液I，剧烈振荡EP管，室温3min

加入300µl溶液II，快速颠倒数次，冰浴3min

加入400µl冰溶液III，温和振荡10s，冰浴5min，12000g×5min转移上清到新EP管，加入等体积酚/氯仿(1:1)，温和振荡，冰浴3min，12000g×5min

上层水相转移到新EP管，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀，-20℃冰箱中放置