分子生物学课件

染色体与DNA分子生物学分子生物学2.1染色质和染色体

染色体(chromosome) Chromosomeisadiscreteunitofthegenomecarryingmanygenes.EachchromosomeconsistsofaverylongmoleculeofduplexDNAandanapproximatelyequalmassofproteins.Itisvisibleasamorphologicalentityonlyduringcelldivision.分裂期染色质(chromatin) Chromatindescribestheconditionofthechromosomalmaterialduringtheinterphase(betweenmitoses)ofthecellcycle.细胞分裂间期

分子生物学一、染色体结构：原核：简单，没有核膜包围形成真正的细胞核，核酸分子常裸露存在整个细胞中，与少量蛋白质结合，这些蛋白质有些与DNA的折叠有关，另外的参与DNA复制、重组和转录过程。真核：染色体位于细胞核的核仁内，DNA与Pro（组与非组蛋白）完全融合，Pro/DNA的质量比2/1。

分子生物学分子生物学原核与真核染色体DNA比较

原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因，只有很少数基因〔如rRNA基因〕是以多拷贝形式存在；整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。

分子生物学染色质的基本单位----核小体

分子生物学核小体(nucleosome)结构DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp)，形成核小体核心颗粒。两个核小体核心颗粒之间有LinkerDNA(0-80bp)，

核小体核心颗粒+Linker=核小体(长180-210bp)

分子生物学分子生物学染色体的结构要素

着丝粒（centromere）：细胞分裂时染色体与纺锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。在着丝粒附近有高度重复的卫星DNA（长约5－10bp、方向相同的高度重复序列），它们不能与组蛋白结合，形成常染色质区域。

端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域。分子生物学端粒DNA的特点与功能：有许多短的正向重复序列。端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3’端突出。端粒DNA末端不能被外切核酸酶和单链特异性的内切核酸酶识别。端粒的功能：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能

分子生物学二、染色体的成分核酸（DNA和极少量的RNA）蛋白质（组蛋白与非组蛋白）分子生物学核酸不重复序列(40-80%)

非严格的“单”，主要是结构基因（2kb）中度重复序列(10-40%)重复10-10000次，rRNA、tRNA、组蛋白基因高度重复序列(10-60%)卫星DNA，重复数百万次，6-100bp分子生物学

以小鼠为例：

1.总DNA的10％是小于10bp的高度重复序列，重复数十万到上百万次/genome。

2.总DNA的20％是重复数千次、长约数百bp的中等重复序列。

3.总DNA的70％是不重复或低重复序列，绝大部分功能基因都位于这类序列中。

分子生物学组蛋白(histone)

一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力。组蛋白分类：

1．核小体核心组蛋白：H2A，H2B，H3，H4。分子量较小(102-135aa)，作用：盘绕DNA形成核小体核心颗粒。

2．H1组蛋白：较大(220aa)，作用：与LinkerDNA结合后利于核小体稳定和更高级结构的形成。

分子生物学非组蛋白

1.非组蛋白的多样性。非组蛋白的量大约是组蛋白的60%～70%，但它的种类却很多。主要是酶、核酸结合蛋白、反式作用因子等。

2. 非组蛋白的组织专一性和种属专一性。

分子生物学三、染色体压缩包装10nm核小体（1/7）30nm螺线管（1/6）超螺旋（1/40）染色单体（1/5）所以DNA以高度压缩的形式（数万倍）存在染色体上分子生物学LevelsofChromatinPacking分子生物学四、染色体特征1.分子结构相对稳定；2.能够自我复制，使亲子代之间保持连续性；3.能够指导蛋白质的合成，从而控制整个生命过程；4.能够产生可遗传的变异。

分子生物学2.2DNA与基因

基因(gene)

是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列。

分子生物学

一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内含子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)

绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。

分子生物学Pre-mRNAIntronsRemovedExonsjunctionsSplittinggene分子生物学DNA链是由脱氧核糖核苷酸通过3’，5’磷酸二酯键聚合而成的高聚物，其一级结构就是指4种核苷酸（A、T、G、C）的连接及其排列顺序，表示了该DNA分子的化学构成。

DNA一级结构

分子生物学分子生物学ATGC分子生物学特殊的DNA一级结构反向重复序列碱基分布不均匀 富含A/T的序列富含G/C的序列所以，一级结构影响高级结构分子生物学DNA二级结构

双螺旋结构

1953年4月Watson和Crick提出DNA右手双螺旋模型分子生物学右手双螺旋模型DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。

DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它遵循碱基互补配对原则。分子生物学分子生物学RighthandedB-formDNADoublehelixModel

每一单链具有5‘3’极性两条单链间以氢键连接两条单链，极性相反，反向平行以中心为轴，向右盘旋(B-form)

双螺旋中存在大沟(2.2nm)小沟(1.2nm)分子生物学DNA单链的延伸3‘端

分子生物学l

碱基顶部基团裸露在DNA

大沟内

l

蛋白质因子与DNA的特异结合依赖于氨基酸与DNA间的氢键的形成l

蛋白质因子沿大沟与DNA形成专一性结合的机率与多样性高于沿小沟的结合l

大沟的空间更有利于与蛋白质的结合

DNA双螺旋的结构特点分子生物学DNA螺旋的几种构象

B-DNAA-DNAZ-DNA分子生物学Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNA分子生物学其他DNA螺旋结构T.S.DNA(TriplexStrands)

三螺旋DNATet.SDNA(TetraplexStrands)

四螺旋DNA分子生物学DNA高级结构超螺旋与拓扑异构现象分子生物学DNA超螺旋结构超螺旋超螺旋，简单地说就是螺旋的螺旋，或者我们假定双螺旋存在一个中心轴，这条中心轴再形成螺旋。超螺旋的形成不是一个随机过程，而是在DNA双螺旋存在一种结构张力时才会形成。由于DNA双螺旋的盘绕过度或不足，使DNA分子处于一种张力状态。在封闭环状DNA分子中这种张力不能释放出来，就会形成超螺旋。分子生物学正、负超螺旋正超螺旋 中心轴的盘绕同双螺旋两条链盘绕的方向相同，也就是同解链方向相反。正超螺旋使螺旋更加紧密，所以把正超螺旋叫过分盘绕DNA。

负超螺旋 负超螺旋能让DNA分子通过调整双螺旋本身的结构来减少这种张力，一般是以减少每个碱基对旋转，即放松两股链彼此的盘绕，所以把具有负超螺旋的DNA叫盘绕不足DNA。分子生物学超螺旋的生物学意义超螺旋可能有两方面的生物学意义：超螺旋DNA比松弛型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，得以包装在细胞内；超螺旋能影响双螺旋的解链程度，因而影响DNA分子与其他分子，如酶、蛋白质分子的相互作用。分子生物学DNA二级结构的形态LinearDNA.LOpenCircleDNAOCSupercoiledcircleCovalentClosedCircleCCCD.S.L1.00D.S.OC1.14S.S.L1.30D.S.CCC1.41Collapsed3.00SvedbergUnit(S)分子生物学

超螺旋结构DNA

绝大多数原核生物的DNA共价闭合环的分子结构真核生物染色体线形分子DNA组蛋白多级螺旋多个类似环型的结构分子生物学●超螺旋结构DNA

leadstoleft-handedsuperhelix

B-DNAoverwinding(右旋)

positivesupercoiled分子生物学Leadstoright-handedsuperhelixB-DNAunwinding(左旋)

所有生物的DNA几乎有5%为NegativeSuperhelix

NegativeSupercoiled

分子生物学超螺旋形成示意末端固定的线型双螺旋额外的张力不能释放双螺旋以扭曲方式缓解应力，形成超螺旋分子生物学Neg.Superhelix

OC,L,DNA

Pos.Superhelix

EB对超螺旋结构的影响分子生物学l

DNA在水溶液中,构型偏B型状态l

DNA以10.5bp/helix为最稳定构型l

小于10.5bp/helix向正超螺旋发展(紧缩态)l

大于10.5bp/helix向负超螺旋发展(松弛态)

对超螺旋的认识分子生物学

在细胞内(invivo)

l

DNA分子需以高度致密的超螺旋状态压缩在细胞核内l

富含AT区域易于解链,形成十字型的负超螺旋,

以消除解链产生的应力,维持DNA分子的稳定状态lB-DNA→Z-DNA→B-DNA调控基因的表达DNA复制RNA转录需D.S.→S.S.状态分子生物学DNA拓扑异构体

具有完全相同顺序，而链环数值不同的DNA，称为拓扑异构体。在封闭环状DNA分子中链环数值的改变，即拓扑异构体之间的互变，只有在一条链或两条链有了缺口时才能发生，通常要有酶来催化，此种酶叫拓扑异构酶。

I型异构酶能在一股链上产生一个缺口，而II型异构酶能在两股链上产生缺口。

分子生物学TopI对负超螺旋处的单链DNA具有极强的亲合力拓扑酶功能比较消除负超螺旋，松弛DNA引入负超螺旋，紧缩DNATopII

拓扑异构酶

(topoisomeraseI,II)参与构型的改变TopIcannotactonpositivelysupercoiledDNA分子生物学负超螺旋的特殊性负超螺旋的引入需要提供能量，可以把负超螺旋看作是一种能量的储存形式。在体内负超螺旋的水平受产生超螺旋和消除超螺旋两种酶活性的平衡控制。在特定区域内增加负超螺旋可能有助于DNA结构上的转变。分子生物学l

细胞内精细调控机制维持

TopI~TopII含量的平衡严格控制体内负超螺旋维持在5%水平保证DNA的各种遗传活动

分子生物学DNA分子的变性

生理状态下双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生的状态之中，特别是稳定性较低的富含A-T的区段，氢键的断裂和再生更为明显。在微观上，它们常常发生瞬间的单链泡状结构，这叫作DNA双螺旋的呼吸作用。

分子生物学DNA分子变性(DNAdenaturation)

●

D.S.DNAS.S.DNA

(加温,极端pH,尿素,酰胺)

变性过程的表现☆

DNA粘度降低☆DNA

沉降速度加快☆DNA分子的A260nmUV值上升核酸在260nm具有强烈的吸收峰，结构越有序，吸收的光越少。游离核苷酸比单链的RNA或DNA吸收更多的光，而单链RNA或DNA的吸收又比双链DNA分子强。分子生物学1.1851.01.37OD℃50μg/mlOpticalDensity

D.SDNAA260=1S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

=OD增加值的中点温度

Tm

(meltingtemperature)

=DNA的50％碱基对发生变性的温度

分子生物学

Marmur-Dotyformula

EvaluationGC%ofDNA

Tm=69.3+0.41×GC%

GC%=30-70%0.15MNacl+0.015MSodiumLimonateTm1

＜

Tm2℃1.01.1851.37OD分子生物学l

增色效应的跳跃现象高分子量的DNA分子在热变性过程中,富含AT区域首先发生变性,然后逐步扩展,表现增色效应的跳跃现象,使变形过程加快.

richAT

richAT

分子生物学DNA分子的复性

D.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renaturation

复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞分子生物学

影响DNA复性过程的因素：

●

阳离子浓度0.18~0.2MNa+

可消除静电斥力●

复性反应的温度Tm-25℃

以消除S.S.DNA分子内的部分二级结构●

S.S,DNA的初始浓度C0●DNA分子中核苷酸的排列状况(随机排列,重复排列)

●S.S.DNA分子的长度S.S.DNA愈长S.S.DNA愈短→分子扩散愈慢→复性愈慢→分子扩散愈快→复性愈快分子生物学复性发生的过程的讨论遵循second–orderkineticsformula

（二级反应动力学）dCt/dt=-KCt2

反应初始t=0●

两条部分同源的S.S.DNA,在复性过程中形成的部分双链区是不稳定的●单链DNA的随机碰撞过程单链DNA浓度=C0反应达t时单链DNA浓度=Ct分子生物学dCt/dt=-KCt2积分Ct/C0=1/1+KC0t当Ct/C0=1/2时Ct/C0=1/2=1/1+KC0t(1/2)K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)=1/K(mol.Sec/L)任一DNA分子达到Ct/C0=½的速率是定值分子生物学

已知大肠杆菌DNA总量为4.4x106bp,Cot1/2=9,有一生物，其Cot1/2=3x10-1，求其细胞中的DNA总量。分子生物学分子生物学基因与基因概念的发展

基因是生物体遗传信息的基本单位，其本质是DNA（有的生物基因组是RNA），简单的说，基因是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA（RNA）序列。原核生物和真核生物的基因有较大的不同，一个典型的真核基因包括：编码序列—外显子；插入外显子之间的非编码序列—内合子；5‘-端和3’-端非翻译区(UTR)；调控序列（可位于上述三种序列中）。分子生物学原核生物与真核生物的基因比较：

1.真核生物除配子外，染色体成对，所以同源DNA分子两个；原核生物只有一个DNA（RNA）分子；2.真核生物基因转录为单顺反子；原核生物基因具有操纵子结构，转录为多顺反子；3.真核生物DNA重复顺序较多；原核一般不具重复序列；分子生物学4.真核生物基因非编码区部分大于编码区部分，无基因重叠现象；原核生物基因编码区部分大于非编码区部分，基因有重叠现象；5.真核生物有内含子（不连续基因或者断裂基因）；原核生物一般无；6.真核生物DNA复制多起点；原核生物DNA复制单起点。分子生物学基因概念的发展

移动基因断裂基因假基因重叠基因分子生物学移动基因移动基因又叫转位因子。由于它可以从染色体基因组上的一个位置转移到另外一个位置，甚至在不同染色体之间跃迁，因此也形象地称之为跳跃基因。

分子生物学跳跃基因

（Jumpinggene/Transposableelement）1914A.EmersonCornelluniversity

玉米果皮花斑突变pVVpvv

1936Marcus.M.RhoabesIndianaUniversity

玉米糊粉层斑点（DottedDt）突变

基因转座现象的最初发现AaDt

DtaA

分子生物学

1947BarbaraMcClintock

玉米糊粉层花斑不稳定现象伴随的遗传事件

a)系列染色体遗传重组事件

b)在Ac(Activater)因子存在时

CI→ci→spotsinaleuronelayer分子生物学断裂基因

过去人们一直以为基因的遗传密码子是连续不断的并列在一起，形成一条没有间隔的完整基因实体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。这种编码序列不连续的间断基因叫断裂基因。

分子生物学不连续的基因表达程序先转录成初级转录物，即核内不均一RNA（hnRNA），又叫前体mRNA；然后经过删除和连接，去除无关的DNA间隔序列的转录物，便形成成熟的mRNA分子；它从细胞核中输送到细胞质，再翻译成相应的多肽链。这种在mRNA成熟过程中其转录物被剪除掉的对应DNA部分叫做间隔序列或内含子，被保留下来的对应的DNA部分叫编码序列或外显子。

分子生物学Pre-mRNAIntronsRemovedExonsjunctionsSplittinggene分子生物学假基因

现已在大多数真核生物中都发现了假基因，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能表达或者表达异常，不能产生有功能的基因产物的失活基因。假基因来源可能有两种：一种可能来源于“亲本基因”的重复和突变；另一种可能来源于mRNA逆转录成DNA插入基因组中形成。分子生物学重复的假基因 许多假基因都是同“亲本基因”连锁的，而且同其编码区和侧翼序列的DNA具有很高的同源性。可见产生此种类型的假基因拷贝的一种可能机理是，由含有“亲本基因”的染色体区段串连重复突变形成。分子生物学加工的假基因 这类假基因没有与“亲本基因”连锁，而且其结构是同转录本而非“亲本基因”类似。例如：它们没有启动子和间隔子，但在3’-末端都有一段延伸的腺嘌呤短序列，恰似mRNA分子3’-末端的Poly（A）尾巴。这些特征表明，此类假基因很可能来自加工的RNA之DNA拷贝，因此称之为加工的假基因。

分子生物学重叠基因

随着DNA核苷酸序列测定技术的发展，在一些细菌和动物病毒中发现了不同基因的核苷酸有时是可以共用的，也就是说不同基因的核苷酸序列彼此重叠。这样核苷酸序列重叠的基因叫做重叠基因。

分子生物学1973年Weiner和Weber发现大肠杆菌的一种RNA病毒中，有两个基因从同一起点开始翻译，一个在400bp处结束，生成较小的蛋白质，而在少数情况下（3％），翻译可以一直进行到800bp处碰到双重终止信号才结束，合成较大相对分子量的蛋白质。但是当时他们认为后者含量少，不予重视，没有进一步研究，就这样他们和重叠基因的发现失之交臂。1977年Sanger在测定ΦX174全部核苷酸序列的时候发现分子生物学

不同终止位点

(Q

RNAvirus1973.A.Weiner)

400Nt800NtAUG----------------------UGA-----------------------UAA

UGA,UAG易被漏读，错读

UAA能严格终止

14KdCp97%38KdIp3%分子生物学X174(F.Sanger,1977)不同的阅读框

---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----ABATGCCN----NNATAA分子生物学--------------TCAUGCCCAAACUAGGC--------------StartStopstopstart不同的阅读框分子生物学---AUG--------TCAUGCCCAA----AUGAGGC--------------Vp2Start

选择不同的起始和终止(SimianVirus40SV40)

SV40Vp1StartVp3StartVp1Vp2Vp3分子生物学基因家族

真核生物的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样一组基因称为基因家族。由于它们功能相关，结构相似且核苷酸序列具有同源性，因此极有可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。

分子生物学基因家族分类单纯多基因家族，即一个基因形成许多串连单位，如5SRNA基因；复合多基因家族，一般是功能相关的基因串连形成，如组蛋白基因家族；发育控制复合多基因家族，这些串连在一起的基因在个体发育不同阶段中分别表达，如珠蛋白基因家族。

分子生物学基因家族的特点基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(genecluster)或串联重复基因，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；在基因家族中发现有些成员不产生有功能的基因产物，即假基因。

分子生物学基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。

每种单倍体基因组的DNA含量是恒定的，全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致。分子生物学植物动物真菌等细菌分子生物学C-值矛盾在结构、功能很相似的同一类生物中，甚至是亲缘关系非常紧密的物种之间，它们的C值相差数10乃至上百倍，人们把这种基因组的大小和物种的遗传复杂度没有直接相关性的现象叫做C值矛盾(C-ValueParadox)。

分子生物学分子生物学基因组研究的具体内容(1)、遗传图谱(2)、物理图谱(3)、基因图谱(4)、序列图谱分子生物学分子生物学4张图谱的相互关系分子生物学分子生物学人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）人基因组3×109(30亿bp)，共编码约3-4万个基因。 基因组学（genomics），包括结构基因组学（structuralgenomics）和功能基因组学（functionalgenomics）。

蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics），后基因组时代的热门课题。补充染色体外的DNA质粒2.

细胞器基因组1.质粒DNA结构与功能

质粒(plasmid)

是某些细菌和真核生物细胞中存在于染色体以外的DNA分子，1kb-200kb不等，大多数细菌的质粒是双链、共价闭合环状DNA分子，以超螺旋形式存在。细菌中普遍存在；宿主范围较窄；独立于染色体之外进行复制和遗传；有多种机制维持其稳定的copy及精确分配给子代；复制转录或多或少依赖宿主编码的酶与蛋白质；含有编码对细菌宿主有利酶的基因（抗生素抗性、限制修饰、降解复杂化合物等）质粒的分类根据复制机理：严紧控制型：严格受到宿主细胞的控制，只含2-3个松弛控制型：生长繁殖不受宿主细胞的限制，几十到几百个

质粒的复制子决定其copy复制子：一个遗传单位，包括复制起点和相关调控元件。质粒复制子：质粒DNA中能自主复制并维持正常copy数的一段最小的核酸序列单位。基因工程最常用：pMB1/colE1质粒的不相容性利用同一复制系统的两个质粒在复制和随后向子细胞分配过程中彼此竞争，因而不能和平共处携带相同复制子属于同一不相容组，不共存在同一细菌中2.细胞器基因组

线粒体基因组： 闭环双链超螺旋，动物的较小，植物的较大。叶绿体基因组： 闭环双链超螺旋，100-200kb，基因无明显成簇现象，rRNA基因多copy，与E.coli有同源序列，基因有内含子。

PCR引物GC含量应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56-62℃范围内，这为有效退火提供足够热度。一对引物GC含量和Tm值应该协调。对于低于20个碱基的引物，可以根据Tm＝4×（G+C）+2（A+T）的经验计算。

DNA复制、修复与重组遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:

一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制控制性状的表达DNA的生物学功能储存遗传信息复制遗传信息表达遗传信息产生可遗传的变异亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,

合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●Replicon;●Replisome;AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA

第一节DNA复制DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃0.5h105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs

复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)

1.复制起点与方向（replicationorigin&direction）

richAT&palindromeEnzymesbindingsite300bp±inreplicationoriginofProkaryoteATrich复制起点的特征

“呼吸现象”

DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显

复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向

子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCA

C5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi

如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

ATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’

G

pppOH

G

5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗

ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH2.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）

1958Meselson-stahl(CsClgradientcentrifuge)Sgenerations01.02.03.04.00+2.00+4.0

N15

N14

DNASemi-ConservationReplication3.DNA半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kbDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）

Okazakifragment1968ReijiOkazakiDNA复制的酶学DNA复制是一个非常复杂的酶学过程，它需要30种以上的酶和蛋白质，人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系，其中一部分酶和蛋白质结合在一起，协同动作，构成所谓复制体（replisome）。DNA聚合反应与聚合酶参与DNA聚合反应的有三种酶：PolI，PolII和PolIII，以四种核苷5’-三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP和dCTP为前体合成聚核苷酸。PolII的具体作用还不清楚，根据实验室工作，它在复制过程中似乎没有什么作用，PolIII极其复杂，是大肠杆菌中是主要的聚合酶。DNA聚合酶活性：

在有引物和模板的情况下，PolI和PolIII都具有DNA聚合酶活性，但PolI的聚合酶活性主要用于DNA的修复和RNA引物的替换，而PolIII才是使DNA链延长的主要聚合酶。

外切核酸酶活性：3’

5’：校对、保真5’

3’：PolIII只作用于单链缺口填充能力PolIII只能填充几个碱基的小缺口PolI可以填充很大的缺口其他酶类DNA连接酶螺旋酶DNA旋转酶………DNA复制的基本过程

DNA复制的基本过程起始链延伸复制终止 真正的酶促机理和新DNA分子合成的步骤是十分复杂的，需要多种特异性酶和蛋白因子的参与，涉及蛋白质、DNA和RNA等生物大分子之间的相互作用。

1.DNA复制的起始

DNA复制起始部位的序列特征

DNA复制都是在特定起始部位(Ori)开始。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，真核生物染色体中有多个Ori。由一个复制起始点构成的DNA复制单位称为复制子。原核生物染色体和质粒都是独立的复制子，真核细胞染色体中会有许多复制子。每个复制子在一个细胞周期中都必须起动而且只能起动一次。

复制起点（origin）一般指的是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌体、细菌染色体、质粒和一些动物病毒的DNA通常具有明显的复制起点。酵母也有特异的复制起点，在细胞周期S期染色体复制时起重要的作用。在真核生物中，复制起点很复杂，迄今仍难于在分子水平上阐明其特征。E.coli、酵母和SV40的复制起始位点的一些共同特征复制起始位点中有多个独特的短重复序列。这些短重复序列被多亚基的复制起始位点结合蛋白识别，这些蛋白对于复制酶在复制起始位点的组装起关键作用。复制起始位点附近一般都有富含AT的序列，以利于DNA双链的解旋，产生DNA复制模板。

复制起始位点共同的作用结合多种蛋白，并有助于它们之间的相互作用，从而有效地起始DNA的复制。复制起始位点可以决定基因组在S期复制的时间顺序。复制起始位点可以防止DNA复制干扰基因在S期的转录。

参与复制起始的蛋白质SSBT抗原ORC、MCMp、Cdc45引发DNA复制的起始就是引物的合成目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链。研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，提供3’-OH，再由DNA聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。

前导链的引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。对于滞后链来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。

DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrand

origindnaGprimase

[RifR]forlaggingStrand

RNApolymerasePrimase(dnaG)(forprimerofLeadingStrand)(forprimerofLaggingStrand)RifS

RifR

合成的RNA分子与合成的非典型的mRNA分子与

DNA模板分离

DNA模板以氢键连接不分离

可以使D.S.DNA解链为单链只能利用单链状态的DNA

状态完成DNA复制的转录激活

为模板合成<12Nt的RNA引物

(也可利用dNt合成DNA引物

)leadingstrand引物的合成是否primase单独存在时没有活性

--由RNApolymerase完成转录只有与相关蛋白(dnaB.C)结合成激活合成的RNA分子作为引物复合体引发体（primosome)--或由primase(dnaG)接替在某种意义上讲,

合成的引物primase译为引物酶？引发酶！

仍无定论！

更为确切！

primosome

SynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase

RNApol(RNApolymerase)[RifS]

dnaG(primase)[RifR]

完成对后随链引物的合成

完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链的延伸DNApolI对后随链的RNA引物切除并聚合填补

连接酶(ligase）将Okazaki片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion2.DNA链的延伸

引发一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3’-OH端按照模板链的碱基顺序，以碱基互补的规则延伸DNA链。无论原核还是真核生物，前导链是按5’

3’方向连续合成，后随链的延伸也是按5’

3’，但不是连续合成，而是先合成多个RNA引物，再延伸为多个冈崎片段，最后连接起来。

原核/真核生物DNA链延伸的不同

主要是催化的酶不同E.coli前导链和后随链的合成都是由DNApolIII催化。SV40前导链和后随链的合成是由二个不同的DNA聚合酶催化完成的(DNApol

向DNApol)

3.DNA复制的终止

一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质参与。但是，环状或线性DNA复制终止的机制却有所不同。

环状DNA复制终止环状DNA复制时，可在离起始点180。相遇，即两个复制叉同时到达一个部位。有些环状DNA分子内含有终止位点，一个复制叉先到达该处停下来，然后另一个复制叉也到达该部位。如在正常情况下，λDNA复制时终止点与起始点相差180。。如果删去一些非必需区域，或者插入一些无关的片段从而改变了复制起始点和终止点的相对距离，经改造后的DNA复制终止点仍保持与起始点相差180。。表明λDNA分子没有特定的终止点。

线状DNA的复制终止及避免5’末端短缩的模式

（5’-endshortend）

3’-OH?

3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?

T7phage

DirectrepeatintheendoflinearDNA

ConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication

(100dNtterminalredundancy)??Concatermer（二联体）3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHReplicationoflinearAdnovirus-2DNA

35937bp

pTP

C

G

IR103-162

IR;including50bpreplicationorigin

richAT&1thC/Ghighconservation

pTP;pre-Terminalprotein80kd→

TP55kdDBP;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;

140kd

复制起始复合体引发复制（不需引物）

避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMP

CG●过程

SSB+ATPDNA末端解链

TPpTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OHIRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNAHairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TP真核生物染色体DNA末端补齐模式

●端粒的发现

1938MullerX-rayDrosophila

末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomer

1938B.McClintock

顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破●端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(richCchain)

●1985.CarolGreider&Blackburn,

1986.Gottchling尖毛虫telomerbindingprotein–155kdtelomerbindingprotein–226kd四膜虫telomerase

将T2G4

末端重复延伸游扑虫

Telomerase=RNACAAAACCCC

链+

末端结合蛋白（TBP）+100bptelomer

●model

TBPisReversetranscriptase-like

RNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNA

ElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’TTG

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’G链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----TTG

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’GGGTTGG链

–T2G4-----TTGGGGTTGGG

C链--A2C4----TTGGGGTTG-------------

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’

telomerase

3’

CCAACCCCAACCCC---5’WhenG-richstrandislongerenough

telomerase

3’

aaaAACCCCAACuuac---5’GGhoogsteenbond

Tetraplexhelix

G链–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC链--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorTelomeraseactivity

isrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.Asthisshorteningreaches

informationalDNA,

thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活

Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度

长短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命

XXXYwhy?PCD机制、癌细胞的无限繁殖DNA复制的调控

λ噬菌体DNA的复制调控

噬菌体和原噬菌体原噬菌体基因组整合在宿主染色体中，不能自主复制，依赖于宿主染色体进行复制，而且噬菌体基因表达被阻遏。几个概念 λ噬菌体感染大肠杆菌以后。可将其基因组整合到细菌染色体上，并成为细菌基因组的—部分，随着染色体DNA的复制而复制。这种整合有噬菌体基因组的细菌称为溶原细菌，这一过程称为溶原途径。溶原性细菌—般不被同种噬菌体再行感染，这一现象称为免疫性。λ噬菌体感染宿主后也可以不通过溶原途径而利用细菌细胞内的成分进行繁殖，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为裂解循环，也称溶菌途径。溶原性细菌受某些外界物理或化学因素（如紫外线、丝裂霉素C等）的作用，原噬菌体可以脱离细菌染色体而进行自主复制，最终导致细菌裂解，游离出大量噬菌体，这一过程称为诱导。

λ噬菌体的生活史溶源性和裂解性的存活方式可以相互转化。

λ噬菌体的lysogenic和lytic两个生活史周期的发育过程是cI、cro、N、Q、cII/cIII等6个基因的控制下进行的。大肠杆菌DNA复制的调控

高度保守的复制起点oriCA/T含量56％；碱基序列高度保守，某些部分种类不十分保守，但数目却是保守的；有9—14个GATC位点，GATC位点中腺嘌呤的甲基化对于oriC的功能不可缺少；有四个高度保守的DnaA识别位点；oriC中没有大于20个密码子的开放阅读框。

oriC质粒复制可分为6个阶段：

转录活化及oriC－DnaA蛋白起始复合物的形成；DnaB、DnaC等蛋白相互作用形成前引物复合体；SSB与解旋酶参与复制，使双链DNA广泛解链并形成前引物合成复合物；由引发酶合成引物，完成复制起始；由DNA聚合酶III全酶在模板—引物复合物的引物3’末端延伸DNA链；由DNA聚合酶I、RnaseH和连接酶完成5’末端的修饰并连接为完整的DNA链，最后由促旋酶形成负超螺旋结构ColE1质粒DNA复制调控Repressormodel

AntisenseRNAmodel

RNA-2positivecontrol

0-5550

RNA-2

RnaseHOH

RNA-2DNA/RNAprimerforDNAreplication

NegativecontrolRNA-1110bp

RNaseH不能识别RNA-2,

不能形成primer

的3’-OH-555

-4450RNA-2RNA-1RNA-2

110bpD.S.RNARNA-10

WhenRNA-2200-360Nt

Rom

geneexpression

RNA-1/RNA-2D.S.repression

RNA-1

/RNA-2

不能形成primer的

3’-OH促进

限制

63aaROP(Romprotein)

RNA-2

只能转录到100-220base,

不能到达“0”原点

不能形成primer

的3’-OH0真核细胞DNA的复制调控

真核细胞的生活周期：

G1：复制预备期

S：复制期

G2：有丝分裂准备期

M：为有丝分裂期DNA复制只发生在S期DNAreplicationatphaseSofcellcycleS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs真核细胞中DNA复制3个水平的调控：细胞生活周期水平染色体水平复制调控复制子水平调控第二节DNA修复（DNArepair）

DNA：遗传与变异遗传性和变异性的基础都是DNADNA损伤是某些因素作用下，DNA的结构和功能发生改变，阻碍DNA的复制与转录，DNA的这种变化称DNA的损伤，基因突变也是DNA损伤的一种。

引起DNA损伤的因素：1、

物理因素：紫外线：产生胸腺嘧啶二聚体电离辐射：引起DNA结构多种程度不同的损伤，这些损伤包括DNA的主链断裂，一条或二条链的断裂，碱基聚合，糖苷键的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。2、

化学因素：烷化剂核苷酸类似物亚硝酸盐和亚硝胺代谢产生的活性物质3、生物因素：DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转坐子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。

突变分类

点突变

DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间的取代，如A被G，或C被T取代，这类取代称转换。不同类碱基间的取代，如A被T，或C取代，T被A或G取代，这类取代称颠换。插入突变在DNA的某一位点插入一个或一个以上的碱基。丢失突变在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。突变可能造成的后果

(1)突变可能使生物更有利于适应环境，这种突变将会保留和遗传，引起生物的进化。(2)导致生物体的死亡或生命力的明显下降，属致死突变。(3)不致死，却引起形态和结构的异常，或发生营养缺陷，或出现新的有害特性。(4)引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。(5)不发生任何变化和影响。

基因突变的特征

(1)突变以一定的机率随机发生;(2)突变有可逆性;(3)突变的发生率可被外界因素所加强;(4)突变是可以遗传的.修复

绝大多数的损伤或突变在DNA未复制前就被修复，保持遗传的稳定性。生物体内存在多种修复机制，采用那一种修复机制对损伤的DNA进行修复，取决于DNA损伤的性质。

复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem复制修复

1.ungsystem(尿嘧啶-N-糖苷酶系统)---TAGC------ATCG------TAGC------A

CG---U---TAGC---ung-aseGCUAU---TAGC------ACG---Apurinase(内切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---2.

MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A

的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)

为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’

-------C----------CTAG----------CTAG----5’5’-----------T----------GATC----------GATC----3’3’-------------------------------------------------------5’少梯度多（m6A）新生链MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

GATCCTAGCTAGTCGATC

GATCCTAGCTAGTGATC

GATCCTAGCTAGTAphR471aaDNA的损伤修复1.photoreactivation----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----Beforereplication&Error-free400nmBluelight&phRgene(photo-reactivationenzyme)可见光激活2.Exision—Repair

BeforeReplicationError-freeUvrA,B,Cgene

EndonucleasesExonucleaseDNApolLigase切补修复E.coli

存活%U.V计量w.t.UvrA+RecA+RecA+

uvra-reca