生化课件：酶详细版课件

酶酵素的发现

公元前9000年已有面包，但酵母的发现却在公元前2000年左右。尼罗河流域盛产小麦，古埃及人将小麦磨成粉，加入水、马铃薯及盐拌在一起，摆在温热的地方，空气中的酵母落入一块未被烤过的面团中，面团竟慢慢地涨大起來，这种面团烤出来后非常松软，从此人们便故意留一块面团，让酵母慢慢使它发大、变酸，再取一团作“面种”留待下次发面包。古埃及人只知道方法，却不懂得其原理，因此一直认为这是神在暗中帮忙，而认定面包是“神的赠礼”enzyme("inyeast")enzyme是希腊文en=in，

zyme=yeast7.1.1酶是生物催化剂生物体内一切生化反应都需要酶的催化才能进行！性能远远超过人造催化剂。定义：有催化作用的生物大分子，具复杂的空间构象，包括蛋白质和核酸。

7.1酶的一般概念7.1.2酶的催化特性与一般催化剂相同的特点1、提高反应速度，不改变平衡点；

2、只起催化作用，本身不消耗；

3、降低反应的活化能

活化能是指在一定温度下，1mol底物全部进入活化态所需要的自由能，单位为KJ/mol生物催化剂的特点7.1.2.1极高的催化效率反应速度是无酶催化或普通人造催化剂催化反应速度的106~1016倍；

且绝无副反应；

酶的催化双氧水裂解7.1.2.2高度的专一性

酶对底物的选择性称为～或特异性结构专一性立体异构专一性绝对专一性相对专一性族专一性键专一性光学专一性几何专一性绝对～：仅催化一种底物反应。如精氨酸酶相对～：能作用于和底物结构类似的物质族专一性——对键和键旁基团有要求又称为基团～键专一性——仅对键有要求，如酯酶光学～：对构型有要求，如L-氨基酸氧化酶几何～：只作用于顺式或反式异构体如延胡索酸（反丁烯二酸）酶光学～和几何～又称立体异构族专一性：可作用于一些结构很相似的底物。RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO2键专一性：可作用于一类很相似的底物。Trypsin

：R1=赖氨酸Lys（K）和精氨酸Arg（R）（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro（抑制）肽链水解位点胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe（F）,色氨酸Trp（W）,酪氨酸Tyr（Y）;肽链水解位点糜蛋白酶分别从肽链羧基端和氨基端水解肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶7.1.2.3反应条件温和常温、常压、中性7.1.2.4生物大分子，极易失活除极个别RNA为催化自身反应的酶外，其余所有的酶都是蛋白质。7.1.2.5体内酶活性受到调控

合成调节—诱导/阻遏（如：乳糖酶乳糖合成酶）降解调节

抑制剂反馈调节酶活性激活剂别构调控、共价修饰、同工酶等

*数量

*活性7.2酶的化学结构7.2.1酶的化学组成①酶水解的终产物是氨基酸，能被蛋白酶水解而失活②酶可变性失活③酶是两性电解质④酶具有不能通过半透膜等胶体性质⑤酶具有蛋白质的化学呈色反应1982年T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNA——ribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。（1）单纯酶：只有蛋白质（2）结合酶（缀合酶）：脱辅酶+辅助因子（全酶）（酶蛋白）辅助因子辅基辅酶{与酶结合紧（金属原子）与酶结合松（有机小分子7.2.2辅助因子羧肽酶NADPH—脱氢酶的辅酶过氧化氢酶结合酶中单独酶蛋白或辅助因子没有催化活性一种酶蛋白一般只与一种辅助因子结合同种辅助因子可与不同的酶蛋白结合酶蛋白：决定反应的专一性辅因子：决定反应的性质（维生素单讲）

7.2.4单体酶、寡聚酶、多酶络合物通过望文生义说说这些酶的区别？酶由一条肽链组成酶为寡聚蛋白几个独立的酶组合起来形成络合体，催化一个系列反应（糖代谢、脂代谢中）7.3酶的结构与功能的关系7.3.1酶的活性中心与必需集团

活性中心（activecenter)

结合中心——与底物结合决定酶促反应的专一性

催化中心——促进底物发生化学变化决定酶促反应的性质

活性中心

酶AA残基活性中心AA核糖核酸酶124HHKRDE溶菌酶129DE胰凝乳蛋白酶241HDS羧肽酶A307REYZn2+胰蛋白酶223HDS必需基团——与酶的活性直接相关的化学基团常见的His咪唑基、Ser-OH、Gluγ-COOH、Cys-SH

位于活性中心活性中心以外，稳定分子构象必需基团非必需基团

酶活性部位的特点1、几个残基+辅助因子（单纯、结合）2、在空间构象上集中到一起（单体、寡聚）3、疏水空穴＋羧肽酶胰蛋白酶的激活缬天天天天赖异缬甘组SS丝SS肠激酶（激活作用）缬天天天天赖异甘组SS丝缬SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶为什么不直接以酶形式存在呢？保护正常组织不受伤害。活性部位7.3.2酶原激活活性中心定义：结合底物，并将底物转变为产物的部位是酶分子上必需基团比较集中并构成一定空间构象、与酶的活性直接相关的结构区域

7.3.3同工酶7.3.3.1定义：是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶7.3.3.2特点：

1、都是寡聚酶

2、不同的亚基组成

3、不同亚基的活性中心非常相似

4、分布部位不同

5、所催化的反应有侧重点

乳酸脱氢酶LDH在电场中电泳时：

—LDH5（M4)LDH4(M3H)LDH3(M2H2)LDH2(MH3)LDH1(H4)+乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+7.3.4调节酶变构酶7.4酶催化机理7.4.1过渡态和活化能E+SESP+Ek1k2k3

中间产物学说

k4E+SESES=EPP+E中间络合物的实验证据：1.ES已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直接观察到2.E和S的光谱特性在形成ES后发生变化3.E的物理性质（如溶解度和热稳定性）在形成ES后发生变化4.已分离得到ES5.超离心沉降过程中，可观察到E和S的共沉淀现象7.4.2酶作用高效率的机理诱导契合学说（机制）专一性高效性与酶专一性有关的学说（1）锁钥学说——刚性构象（2）结构性质互补学说

——静电效应、极性相同（3）诱导契合学说

诱导嵌合学说－柔性学说（Koshland，1958）：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。（底物也会变形）。7.4.2.1底物和酶的邻近效应和定向效应

酶与底物靠近

定向

酶与底物相互诱导变形

契合形成中间产物

产物脱离靠近静电吸引、疏水作用定向底物酶7.4.2.2底物的形变和诱导契合诱导互补性结构变化契合活性中心催化基团进行催化能否契合—专一性的由来

契合后，诱导“电子云形变”:EA:B:A-:B+:电子云形变羧肽酶A＋羧肽酶催化中的电子云形变

C＋=O－靠近

电子云形变

定向极性专一性契合区H2+N＝C精氨酸C端确认区注意＋这样的共价键易于被酶活性中心酸碱催化或共价催化7.4.2.3酸碱催化酶活性中心提供H+或提供H+受体使敏感键断裂的机制称酸碱催化。酸催化(－OH、－NH3+、＝NH+、-COOH、－SH)A-:H+EHE-H2OEH+OH-+H+AH+B+碱催化(失电子态)A-:B++E-COO-A-+E-COOH

E-COO-

+H+碱催化＋酸催化稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳A-:B+7.4.2.4共价催化酶活性中心亲电基团或亲核基团参与底物敏感键断裂的机制称共价催化亲电基团——带正电荷性质的基团亲核基团——

¨+-OH-NH2咪唑基

亲电催化2A-:2B++

Mg2+A:Mg¨A

+2B+亲核催化¨-OH¨-SHA-

+HO:B中间产物不稳定，断裂，相互结合形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）¨－OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)4.丝氨酸蛋白酶的催化机制7.4.2.5活性部位微环境的影响

活性部位位于酶分子表面疏水环境的裂缝中，非极性环境中的介电常数较在水介质中低，根据库仑定律，在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高。疏水环境有利于酶的催化作用7.1.3酶活力测定

7.1.3.1酶活力酶活力就是酶催化反应的能力。人的能力——能办多大的事酶的活力——能催化多快的反应通常以测出的酶促反应速度表示酶的活力；

酶促反应速度的测定方法产物浓度变化曲线用哪一个速度来表示该酶促反应的速度特征呢？反应初速度Vo反应初速度表示酶活力。为什么用反应初速度表示酶活力？1.底物浓度降低，2.酶在一定pH下部分失活，3.产物对酶的抑制，4.产物浓度增加而加速了逆反应的进行。7.1.3.2酶活力单位(U)

活力单位---在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量和产物生成量来表示例如：每小时催化1克底物每小时催化1ml某浓度溶液每分钟催化1ug底物（1）（IU）——在标准条件下（25℃，最适pH和最适底物浓度）一分钟内催化1微摩尔（

mol）底物转化的酶量。（2）Kat——在标准条件下（25℃，最适pH和最适底物浓度）每秒内催化1摩尔（mol）底物转化的酶量。7.1.3.3比活力酶产品质量评价中常使用比活力单位质量酶产品中酶活力称比活力。

u/mg酶蛋白

u/ml酶蛋白酶活力测定实例首先确定反应条件

20℃、pH=7，底物浓度6g/l（过量），加入2mg固体脂肪酶第二确定活力单位

如每小时催化1克底物1u=1g/h第三测算反应初速度

作产物甘油随时间增加的曲线，量出反应初速度值，换算为脂肪的消耗速度如8g/h第四换算活力

8g/h

/

1g/h=8u第五计算比活

8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油+脂肪酸纯化倍数

=提纯后的比活力/提纯前的比活力

8u/mg酶蛋白/4u/mg酶蛋白=2

回收率

=提纯后的总活力/提纯前的总活力

40u/50ux100%=80%7.5酶促反应动力学7.5.1底物浓度对酶反应速度的影响前提：米氏酶

1、单底物

2、酶与底物只有一个结合位点

3、酶定量反应初速度随底物浓度变化曲线E+SESP+Ek1k2k3中间产物学说

k4E+SESES=EPP+E7.5.1.2米氏方程（MichaelisMenten)V=Vmax[S]Km+[S]Km=

k2+k3k1米氏常数

a.当[S]很小时V=V[S]/Km一级反应反应初速度随底物浓度变化曲线米氏曲线V=V[S]Km+[S]b.当[S]很大时V=V[S]/[S]=V

0

级反应混合级Km=?Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]

7.5.1.3米氏常数Km的意义

A.酶的特性常数（与pH、温度有关，与酶及底物种类有关，与酶浓度无关），可以鉴定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0B.可以判断酶的专一性Km越小，亲和力越强。底物浓度很小时，反应速度就能达到很大，性能优，代谢中这类酶更为重要。C.大小表示酶对底物的亲和力大小，判断天然底物D、Km可以帮助判断某一代谢反应的方向和途径

a、可逆反应：Km较小者为主要底物

b、多酶催化的连锁反应，Km大者为限速步骤乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。C、一底物多酶反应E、根据Km，判断s与v之间的关系F、判断机体中底物的量己糖激酶以葡萄糖为底物时，km=1/2[S],其反应速度v是Vmax的A.67%B.50%C.33%D.15%E.9%G、判断抑制剂的类型Lineweaver-Burk双倒数作图法7.5.1.4Km与V的求取蔗糖酶米氏常数（Km）的测定蔗糖酶（

-D-呋喃型果糖苷**酶EC3.2.1.26）1.配12支蔗糖底物浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M（在35度水浴保温）2.加入3单位/毫升的酶溶液（已在35度水浴保温），准确作用5分钟，终止反应3.各吸取0.5毫升反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值4.作图

7.5.2酶浓度对酶反应的影响当底物浓度足够大时，所有的酶都被底物结合，酶促反应速度达到最大。

V=Vmax=K3[E]

7.5.3pH对酶反应的影响最适pH时的酶活力最大胃蛋白酶木瓜蛋白酶胆碱酯酶胰蛋白酶相对酶活力过氧化氢酶胃蛋白酶胰蛋白酶精氨酸酶延胡索酸酶RNA酶pH对酶活力产生影响的原因？

1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。影响契合，影响催化酶最适pH，因酶而异，大多数酶最适pH在7.0左右。

7.5.4温度对酶反应的影响上图反映出温度如何影响酶活力？产物累积量相对酶活％

最适温度

最适温度动物酶

35~40℃植物酶40~50℃微生物大部分

40~50℃个别高温菌100℃以上

温度越高，活化分子越多，反应速度快，但酶变性时间越短，反应速度下降也迅速。最适温度与反应时间有关，时间短，最适温度高，时间长，则低。

生物样品若制成干粉，可放置在室温下保存，而处于溶液状态时必须放在冰箱里保存。原因何在？低温无水使微生物降解酶活性低

7.5.5抑制剂对酶反应速度的影响引起酶活性降低的因素：失活作用（inactivation）

——

变性剂改变酶的天然构象去激活作用(deactivation)

——与酶的激活剂结合抑制作用（inhibition）

——与酶结合，但不改变酶的天然构象

依据：

能否用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，使酶复活抑制作用分可逆抑制与不可逆抑制。7.5.5.1不可逆抑制：否原因？必需基团与抑制剂以牢固的共价键相连；很多为剧毒物质重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、毒鼠强等等。不可逆抑制剂

非专一性不可逆抑制剂（对酶的选择性不是很强）

专一性不可逆抑制剂（与特定的酶结合）

非专一性不可逆抑制剂

A、重金属离子

H2N-CH-COOH

CH2

SH

H2N-CH-COOH

CH2

S-CH2COOHICH2COOHHI

B、碘乙酸++

专一性不可逆抑制剂

有机磷农药（敌百虫、沙林）胆碱酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱如何紧急救治呢？排毒洗胃、喝鸡蛋清牛奶导泄、利尿血液灌流（“大换血”）血液透析（清除游离状态毒物）

找特效药：解磷定7.5.5.2可逆抑制：抑制作用可通过透析等方法除去原因：是－非共价键结合（1）竞争性（Competitive)抑制“I”抑制剂（inhibitor）利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药抗菌机理（与对氨基苯甲酸是结构类似物）—竞争性抑制细菌叶酸形成，进而抑制细菌繁殖人通过食物中的叶酸直接补充，对人无毒害。抑制物（2）Noncompetitiveinhibition反竞争性（Uncompetitive抑制）竞争性——抑制剂（I）与底物与酶活性中心结合的机会均等

（1）V下降，发生抑制（2）Km增大，亲和力下降（3）Vmax不变（底物浓度增大，抑制剂结合机率减小）

Km变大，Vmax不变V、Km、Vmax?（1）V下降，发生抑制（2）Km不变，酶与底物亲和力不受影响（3）Vmax减小（一部分酶始终失活）

2.非竞争性抑制Km不变，Vmax变小3.

反竞争性抑制作用[S]vkmk’m

各种类型抑制的表观Km及Vmax

7.5.6激活剂对酶反应的影响什么是激活剂？激活——活性提高剂——物质能提高（酶）活性的物质——（酶）激活剂（一）无机离子阳离子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Zn2+等阴离子Cl-、Br-等机理？与底物结合，使底物形状更适合酶的活性中心屏蔽电荷效应有时可互相替代，有时互相颉颃（二）中等大小的有机分子

1.某些还原剂如Vc、半胱氨酸机理：还原酶活性中心的二硫键

-S-S-→-SH+-SH

参与催化

2.EDTA（乙二胺四乙酸）

解除重金属抑制（三）某些激酶无活性的酶激酶作用下，切除或添加基团有活性的酶激活剂对酶的作用具有选择性，即对一种酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用

7.6酶活性的调节控制

调节酶7.6.1变构调节1、定义

变构——蛋白质在实现生物功能时构象发生变化，活力改变的现象。变构酶——具有变构现象的酶变构剂——能使酶分子发生变构作用的物质变构激活剂变构抑制剂2、变构酶的特点多亚基一部分亚基有活性中心————催话亚基另一部分有变构调解中心————调节亚基效应物（调节物、别构剂）底物其他对底物与酶的结合能力促进同促反应正协同效应异促反应正协同效应抑制同促反应负协同效应异促反应负协同效应（2）变构酶的动力学：

当底物也是调节物，不服从米氏方程V=V[S]Km+[S]米氏酶：当V=90％V0.9Km=0.1[S]［S］＝9Km当V=10％V［S］＝1/9Km[s]10%V(米氏）[s]90%V=81[s]10%V(正协同）[s]90%V=3当V=10％V［S］＝3Km(正协同）S曲线：正协同＜81(开关)—V↑随［S］↑而加快2米氏曲线1负协同3正协同321V10%V90%V0[S]V

仅底物是别构调节物时

双曲线：负协同＞81—V↑随［S］↑而减慢底物是别构抑制剂底物是别构激活剂正协同：

当[S]较小时，V很小；在曲线较陡的范围内，[S]发生较小的变化，会使V发生很大的变化。在此范围内，酶对底物浓度非常敏感，活性受底物浓度的调节。机体对底物的浓度要求很高，必需在一定的范围内。7.6.2可逆的共价修饰共价调节酶通过其它酶对其多肽链上的某些基团进行可逆的共价修饰，使酶处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶的活性R磷酸酶磷酸化激酶糖原磷酸化酶b活性低糖原磷酸化酶a活性高磷酸化激酶磷酸酶7.7酶的命名和分类7.7.1命名（1）习惯名催化的底物名+酶反应类型+酶或催化的底物名+反应类型+酶

如：

琥珀酸脱氢酶、天冬酰胺合成酶蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶？水解酶一般省去“水解”二字加上来源或其它性质：如胃蛋白酶、碱性磷酸酯酶（2）国际系统命名法：底物1：底物2+反应性质+酶

乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶当底物为水时，可省略（3）国际系统分类编号：酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示底物/产物的性质）第四位：在亚类中的序号乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号1.氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应AH2+B（O2）A+BH2

7.7.2六大类酶的特征转移酶类：催化化合物中某些基团的转移A·X+BA+B·X3.水解酶类：催化加水分解作用AB+H2OAOH+BH4.裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。CH3C=OCOOHC—C键CH3C=OH+CO2C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH3异构酶：催化各种异构体之间的互变常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。AB合成酶类：催化有ATP参加的合成反应A+B+ATPA·B+ADP+Pi7.8酶的应用7.8.1工具酶胶原蛋白酶：分解细胞连接，培养细胞各种蛋白质酶：提取核酸时，破细胞壁限制性内切酶（核酸）：产生粘性末端Taq酶：PCR扩增合成DNA7.8.2固定化酶什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体固定化技术水不溶性酶

水不溶性酶不等于固定化酶

固定化酶是通过物理的或化学的手段，束缚于水不溶的载体上，或柬缚在一定的空间内（包埋），不能自由流动，但仍有催化活性的酶。

immobilizedenzyme

把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。

7.8.3抗体酶（Abzyme)概念：抗体酶或催化抗体（Catalyticantibody)是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。能将抗原变成产物。1、酶作用机制的中间产物学说E+SESES=EPP+E2、酶作用机制的诱导契合学说

若利用酶的过度态底物做抗原，应该产生一种抗体，能与底物结合，并具备很高的催化活性。

过渡态底物：被诱导出来。不稳定。过渡态类似物：人工合成，与酶促反应中底物的中间过渡态结构相似的物质，性质稳定，能与酶紧密相连，，可作为半抗原，与载体蛋白结合，诱