电刺激海马ca1区、ghrp-6对大鼠下丘脑室旁核胃牵张神经元放电活动的影响

电刺激海马ca1区、ghrp-6对大鼠下丘脑室旁核胃牵张神经元放电活动的影响

海瑞是边缘系统的一个重要整合中心，主要参与认知、学习和存储功能的调节。近年的研究表明,海马在摄食、胃运动、能量代谢的调节中同样发挥着重要的作用。形态学研究表明,海马与杏仁核、下丘脑、延髓等中枢脑区有着丰富的纤维联系,这些神经核团共同作用,通过对内脏传入传出信号的整合处理,完成对摄食相关功能的调控。下丘脑室旁核(PVN)是中枢内调节能量代谢的重要脑区,是消化功能传入传出信息的重要转换站。PVN内的多种神经肽参与摄食行为和能量平衡的调节,主要包括NPY、ghrelin、motilin等。其中ghrelin是1999年发现的一种由28个氨基酸组成的脑肠肽,是一种生长激素促分泌激素受体(GHSs-R)的内源性配体。ghrelin除了分布在胃、肠、胰、肾等外周组织器官之外,在下丘脑、垂体等中枢部位亦有表达,主要参与摄食、能量平衡、胃酸分泌等的调378青岛大学医学院学报48卷节。海马作为高一级的调控中枢,是否可以通过调控下丘脑PVN神经元的活性进而对摄食和胃运动进行调节,这一神经通路是否有ghrelin的参与,至今未见报道。本研究采用核团微量注射及神经元细胞外记录方法,探讨ghrelin在海马-PVN调控通路中的作用,为中枢ghrelin调控脑功能的研究提供新的实验依据。1材料和方法1.1实验材料1.1.1体质量、饲养时间健康成年雄性Wistar大鼠(由青岛市药检所提供)89只,体质量250~350g,置于室温(25±2)℃、12h-12h昼夜循环光照条件下饲养,自由摄食、饮水。实验前适应性饲养1周。1.1.2电子刺激器、微电极放大器、u3000ew-4001mez-4001自制双极刺激电极(除尖端0.1mm外均绝缘,极间距0.5mm);SSEW-3301电子刺激器、MEZ-8201型微电极放大器、VC-Ⅱ型双道记忆示波器和SUMP-PC生物电信号处理系统,均由日本光电公司生产。ghrelin、[D-Lys-3]-GHRP-6和荧光金(FG)购自美国Sigma公司。1.2实验方法1.2.1胃牵张抑制脑牵张大鼠用200g/L乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉,颈部正中纵行切口,行气管插管术。胃部手术:腹部正中纵行切口,经胃底部切口将胃内容物取出,以温生理盐水清洗。置入一薄软胶气囊,经聚乙烯软管连至一支5mL注射器,实验中注入生理盐水(3~5mL,0.5mL/s,37℃)扩张胃,用以鉴别胃牵张(GD)敏感神经元,缝合腹部。头部手术:头部正中切口,牙科钻颅骨钻孔,插入刺激电极至海马CA1区,定位参照Paxions-Watson大鼠脑图谱(前囟后3.4mm,L(R):1.6mm,H:3.0mm);刺激参数:强度0.1mA,频率50Hz,波宽1ms,刺激时间5s。在PVN对应颅骨表面位置钻孔,覆盖20g/L琼脂生理盐水与颅骨表面平齐,以保护脑皮质及作为颅骨表面定位标志;施行小脑延髓池穿刺术引流,以减少脑波动对微电极位置的影响。1.2.2gd-i神经元/gs-i神经元/gs-i神经元的检测采用三管玻璃微电极(电极尖端总直径约3~10μm,电极阻抗5~15MΩ),其中一管作为记录电极,其内充灌20g/L滂胺天蓝溶液,另外两管分别充灌1.5×10-8mol/Lghrelin,2.8×10-8mol/L[D-Lys-3]-GHRP-6或生理盐水。通过监听器判断电极尖端进入空气与琼脂界面,用液压推进操纵器将微电极送至PVN(前囟后1.3~2.3mm,中线旁开0.5~0.8mm,距离颅骨表面7.7~8.4mm)区域内,鉴别GD敏感神经元,以神经元放电频率的变化率超过20%作为神经元兴奋或抑制标准,神经元表现兴奋的确定为GD-E神经元,表现为抑制的确定为GD-I神经元。观察细胞电信号与噪声比在3∶1以上,进行细胞外放电记录。由PM2000B4-channelProgrammablePressureInjector(MDI,USA)压力给药系统经三管玻璃微电极的另外两管给药,观察神经元放电频率的改变,或电刺激海马CA1区,观察PVN内GD敏感神经元电活动的改变。信号经MEZ-8201型微电极放大器输入VC-Ⅱ型双道示波器,电信号经由示波器同步Y轴输出,经SUMP-PC生物信号处理系统进行放电频率分析,并绘出序列密度直方图。1.2.3微电泳标记每次实验结束后,微电极接阴极,无关电极接阳极,以电流强度为10μA的直流电通电20min,通过微电泳使电极内的滂胺天蓝泳入脑组织,标记微电极所在位置;先后用生理盐水和40g/L甲醛溶液经左心室灌流,快速断头取脑,置于40g/L甲醛溶液内浸泡2d,做50μm系列冠状切片,中性红染色,检查电极记录位置,位置不准确的资料不列入统计。1.3两组放电频率的比较各组神经元放电频率以x¯±sx¯±s表示,细胞给药前后放电频率比较采用配对t检验,两组数据比较采用成组t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.1grtelin神经元在海马调控脏器相关药物活动中的表达在89只大鼠的PVN共记录到109个神经元单位放电,胃牵张刺激可以兴奋其中的71个神经元(72.5%),神经元平均放电频率由(2.48±0.39)Hz增加至(3.69±0.62)Hz(t=2.89,P<0.01),鉴定为GD-E神经元;另外有38个神经元对胃牵张刺激表现为抑制反应,神经元的平均放电频率由(1.65±0.21)Hz下降至(0.91±0.19)Hz(t=3.41,P<0.01),鉴定为GD-I神经元。在71个GD-E神经元中,微量注射ghrelin可兴奋其中51个神经元(72%),放电频率由(2.04±0.44)Hz增加至(2.60±0.48)Hz,放电频率平均增加(38.9±7.3)%(t=2.85,P<0.01),与生理盐水5期齐玉霞,等.ghrelin在海马调控下丘脑室旁核胃牵张敏感神经元活动中作用379组的(2.10±0.55)Hz(n=45)相比差异有统计学意义(t=2.21,P<0.05);另外有18个神经元放电频率无明显变化,有2个神经元在给予ghrelin后出现抑制反应。ghrelin兴奋的神经元,在给予ghrelin受体阻断剂[D-Lys-3]-GHRP-6后,再给予ghrelin,兴奋反应不再出现。在38个GD-I神经元中,微量注射ghrelin可抑制其中23个神经元(60%),放电频率由(1.53±0.39)Hz下降至(0.65±0.15)Hz,平均减少(45.2±6.3)%(t=3.08,P<0.01),与生理盐水组的(1.49±0.51)Hz(n=21)相比差异有显著性(t=2.57,P<0.05);另外有12个神经元的放电频率无明显变化,有3个神经元出现兴奋反应。ghrelin抑制的神经元,在给予ghrelin受体阻断剂[D-Lys-3]-GHRP-6后,再给予ghrelin,抑制效应不再出现(图1)。2.2神经元放电频率在41个对ghrelin有兴奋反应的GD-E神经元中,电刺激海马CA1区,可兴奋其中16个神经元(39%),神经元放电频率由(2.67±0.57)Hz增加至(3.54±0.69)Hz,平均增加(78.9±11.6)%(t=3.95,P<0.01),其余神经元的放电频率无明显变化;在15个对ghrelin有抑制反应的GD-I神经元中,电刺激海马CA1区可以兴奋其中5个GD-I神经元(33%),神经元放电频率由(2.15±0.69)Hz增加至(2.85±0.82)Hz,平均增加(51.4±9.3)%(t=6.05,P<0.01),其余神经元的放电频率无明显变化(图2)。2.3第一次电刺激海马在电刺激海马CA1区后,有兴奋效应的16个GD-E神经元中,给予[D-Lys-3]-GHRP-6后,再次电刺激海马,有7个神经元(44%)的放电频率与第一次给予电刺激后相比明显降低((86.3±15.4)%vs(51.2±10.7)%;t=2.97,P<0.05)。而在电刺激海马后有抑制反应的5个神经元中,给予[D-Lys-3]-GHRP-6后,再次电刺激海马,神经元的兴奋效应无明显变化((41.8±8.5)%vs(45.1±9.3)%;t=0.92,P>0.05)(图2)。3grtelin调控pvn的神经元/传导束GD可兴奋胃壁机械性感受器,兴奋通过迷走传入纤维上传至延髓、下丘脑及其他脑区如海马、杏仁核、皮质等,引起进食后系统性的情绪、心理及自主神经系统的活动反应。电生理学上利用对GD的电应答反应,鉴定消化道机械感受性传入信息的神经途径,用以研究参与调控胃肠功能的中枢部位及影响其活动的神经体液因素。中枢内的一些脑肠肽,如motilin、ghrelin、nesfatin-1等可以通过改变脑内的GD敏感神经元的活性,进而影响到胃运动和摄食活动。本实验结果显示,GD可以通过外周神经上传至PVN,在PVN记录到对GD表现为兴奋反应的GD-E神经元和表现为抑制反应的GD-I神经元。已有的资料显示,PVN内有ghrelin受体的表达。本实验表明,外源性ghrelin微量注射可以兴奋PVN内的GD-E神经元,抑制GD-I神经元,且这种作用可以被ghrelin受体阻断剂所阻断,说明其作用是通过ghrelin受体介导的。PVN与边缘系统的杏仁核、海马及延髓孤束核、迷走运动背核等胃肠功能调节中枢都有明确的神经投射联系。因此推测,ghrelin改变PVN内的GD敏感神经元的兴奋性,这些神经元将信号传导至与PVN有神经纤维联系的其他中枢脑区,这些摄食相关中枢整合信号,产生相关情绪、心理反应,最后通过迷走神经作用于外周胃肠道,完成对摄食和胃运动的调控。380青岛大学医学院学报48卷研究显示,海马可以通过对摄食相关信号的处理,参与胃运动和摄食功能的调控。损毁大鼠海马,可以引起大鼠摄食量和体质量的增加。海马内可记录到和GD相关的神经元,且该类神经元的兴奋可以调节清醒大鼠胃运动。本文电生理实验结果显示,电刺激海马CA1区可以兴奋PVN的GD敏感神经元,且这种作用在一定程度上可以被ghrelin受体阻断剂所阻断。提示海马CA1区可通过与其下位中枢PVN的相互作用,进而影响到胃运动及摄食活动,且ghrelin能神经通路参与了这种调控的完成。由于海马与皮质、杏仁核、下丘脑及延髓之间有着广泛的纤维联系且以上核团与PVN之间也存在相互的纤维投射,所以不能排除电刺激海马CA1区所引起的PVN内神经元的电活动改变是通过以上神经中枢的介导而引起的间接反应。本研究结果还显示,g