巨噬细胞raw2647培养方法和电转染条件的优化

巨噬细胞raw2647培养方法和电转染条件的优化

mct是一个重要的免疫反应细胞，在特定免疫反应和非特异性免疫中发挥着重要作用。且年龄老化可导致肌肉巨噬细胞功能的不完整。巨噬细胞作为机体的第一道防线,在抵抗病原微生物和其他异物、保护机体的健康方面作用重大,一些疾病的发展是由于巨噬细胞中某些基因的表达量低或无表达所导致,这就需要用转基因的方法把外源基因导入巨噬细胞使其在巨噬细胞中表达,达到防治疾病的目的。随着分子生物学技术的发展,转基因技术在畜牧业和医学领域上逐渐显示出广阔的应用前景,不仅加速了家畜品种的改良,而且提高了畜牧业产品的品质。细胞转染技术为研究特定的基因表达调控和基因定位提供了基础。常用的细胞转染方法有电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质体法、逆转录病毒介导转染法等。而电转染法是一种快速,有效的将外源基因导入哺乳动物细胞或组织的转染方法,目前已被广泛应用于科学研究。但是电转染的效率受很多因素影响,包括温度、载体的结构、载体大小、浓度、细胞的数量、细胞的生长时期,电转染前后样品的静置时间,电转染仪器的参数,如电压、脉冲时间、电击次数。因此必须对转染条件进一步优化才能提高基因转染效率。虽然电转染受很多因素影响,但与磷酸钙法、阳离子性的脂质体法、显微注射法等基因转移方法相比,电转染仍然是高效转染的理想方案。笔者以巨噬细胞RAW264.7为研究对象,进一步优化电转染条件,建立一套适合巨噬细胞的电转染技术,为今后研究基因高效转染巨噬细胞提供依据。1材料和方法1.1废水处理200904301814购自中国科学院细胞库,该细胞贴壁牢固。图1为培养的RAW264.7细胞。1.2lb培养基培养pEGFP-C1菌种由西北农林科技大学家畜生殖生理与胚胎工程重点开放实验室保存,将其接种到LB培养基中,摇菌然后提取质粒。用质粒pEGFP-C1转染RAW264.7细胞株,借助绿色荧光蛋白标记,判断转染效率。1.3细胞培养的培养RAW264.7细胞用含有φ=10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640(GIBCO)培养基在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,2~3d细胞长满,即可传代培养。图1和图2是不同放大倍数下观察的巨噬细胞。1.4检测细胞的表达电转染仪为ECM2001BTX(美国),转染前2d解冻3管细胞,加到3个6cm皿中,待细胞密度大约达2×106/mL时,消化收集细胞(1000r/min,4min),用Opti-MEM•IReducedSerumMedia(invitrogen公司)洗涤细胞2次,每次清洗时要轻慢地吹打细胞,防止其受损,将电转染液[电转染液的配方:V(cell盐)∶V(options)=3∶1,KCl120mmol/L,CaCl20.15mmol/L,K2HPO410mmol/L,MgCl250mmol/L,pH7.6]和质粒(20μg)混合液加到经离心弃去培养液的离心管中,轻轻吹打细胞,将其完全吹散,混匀。将上述细胞悬液转到BTX电击杯中(4mm间隙,黄色盖子,容积800μL),静置10min,选择不同的电压、脉冲时间、电击次数等条件组合后电击细胞。细胞静置10min,将细胞悬液加到6cm培养皿中。加入37℃预温的含φ=10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液4mL。将培养液置于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,2h后细胞贴壁,弃去培养液(培养液中的电转染液影响细胞生长),换成经37℃温育的RPMI1640完全培养液。经24h后观察荧光情况。转染后细胞形态明显增大。转染效率=(发出绿色荧光的细胞数/可见光下总细胞数)×100%。图3为转染后普通光下细胞。图4为荧光显微镜下绿色荧光蛋白。图4是在350V、脉冲时间30ms、4℃下本试验所配的电转染液转染的一个视野。统计方法采用算术平均值法,随机取3个视野的平均值。2结果与分析2.1贴壁密度和传代RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。细胞核圆形或椭圆形,染色较深。贴壁特别牢固。每次传代都很难消化下来。用力过大吹打则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长梭形,并且不能恢复,这是培养这种细胞时最需要注意的问题。在本试验中发现两种方法比较适用,其中在细胞传代时用细胞刮刀(可重复使用)比用胰酶消化效果较好。2.2影响壮族28.7染色的条件2.2.1电转染效率比较将pEGFP-C1转染RAW264.7细胞,在脉冲时间10ms、电击1次、电击缓冲液为电转染液、37℃的条件下,当电压为250、280、350、420V时电转染效率分别为30.1%、33.1%、39.1%、42.3%;420V时转染效率最高,随着电压升高电转染效率增加,但细胞死亡率(死亡率通过倒置显微镜大体判断)也增加;350V为最佳电压。2.2.2电转染脉冲时间在350V的最佳电压和37℃下,电击1次且电击缓冲液为电转染液时,可见:当脉冲时间为10、20、30、40ms时电转染效率分别为39.1%、33.2%、41.2%、36.2%,30ms时荧光数量最多。2.2.3电弧次数设定在电压350V、脉冲时间30ms、电击缓冲液为电转染液、37℃时,电击次数设定为1~4次。结果发现:电击1、2、3、4次的电转染效率分别为41.2%、37.8%、35.2%、31.8%,350V、电击1次时转染效率最高。2.2.4电转染效果的测定在电压350V、脉冲时间30ms、电击1次、电击缓冲液为电转染液的条件下,比较4、20、37℃时的电转染效率(试验在含有空调的层流间完成)。结果表明:4、20、37℃下,电转染效率分别为46.8%、43.5%、41.2%,4℃时转染效率最高。2.2.5电转染液[v东北部在电压350V、电击1次、脉冲时间30ms和4℃条件下,电击缓冲液分别采用电转染液[V(cell盐)∶V(options)=3∶1]、RPMI1640培养基、不含Ca2+和Mg2+的PBS时,这3种电击缓冲液的电转染效率分别为46.8%、42.7%、41.5%,当电击缓冲液为电转染液时转染效率最高。3输注pbs和活性小体细胞后细胞的分离和纯化巨噬细胞贴壁牢固,不易传代,笔者在培养这种细胞的过程中发现两种方法比较适用。一种方法:①将培养瓶内旧的培养液吸出弃掉,然后用无Ca2+、Mg2+的PBS彻底清洗3次(务必清洗干净,否则残留的血清会影响胰酶的消化能力);②加入2.5mg/mL胰酶-EDTA于37℃消化2min,显微镜下观察到细胞变圆,间隙增大;③随即加入含100mL/LFBS的培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,这时用吸管吹不下来,但刮刀却很容易刮下来,而且对细胞的损伤较小;④离心,弃上清,加新的培养液(100mL/LFBS),小心吹打混匀,分装入新的培养皿;该方法对消化巨噬细胞非常好,用常规方法消化2min,很难将细胞消化下来。另一种方法是:①将要传代细胞的培养液弃掉,用无Ca2+、Mg2+的PBS把细胞彻底清洗干净(洗不干净会影响胰酶的消化作用);②加2.5mg/mL胰酶-EDTA,37°消化10min,细胞才被消化下来,消化下来的细胞呈团块状。该细胞聚成的团块不容易吹散,要慢慢多吹几次,吹打均匀。用1mL枪头把细胞悬液转移到5mL离心管(提前加入1mL完全培养液),用5mL注射器慢慢吹打混匀细胞。这样对细胞的损伤小些。在这两种方法中第一种方法比第二种方法好,可能是因为第二种方法消化时间太长对细胞损伤较大,细胞死亡率较高。传代也不太好。第一种方法对细胞损伤很小,传代也容易。细胞种类不同,其电转染条件就不同,巨噬细胞又是非常重要的免疫细胞,通过基因转移可以了解疾病机理,探讨疾病治疗方案,因此有必要探讨它的转染条件。电穿孔是一种高效的基因转移方法,通过控制影响转染的因素,可以提高转染效率。其中电压是影响电转染的关键因素,电压太高太低都会影响转染效率。在电穿孔中外加电场使细胞膜内外电压发生改变,形成电压差导致膜暂时穿孔,细胞受电击后,膜上产生的孔洞使细胞质与电击缓冲液直接接触,电击缓冲液组分能直接进入细胞内,由于细胞对电击缓冲液的离子组成和渗透压非常敏感,因此组分与细胞质类似的缓冲液可能有利于细胞电击后的存活,因此选择电击缓冲液的时候尽量使其组分与细胞胞质成分类似。4℃比20和37℃转染效率高,可能是因为在电击过程中产生热量使电击缓冲液温度升高影响了缓冲液本身的导电性能。转染效率可能与细胞生长状态有密切关系,也可能与其他因素有关,需要进一步