复元醒脑汤对糖尿病脑梗死大鼠脑水肿和血-脑屏障通透性的影响

复元醒脑汤对糖尿病脑梗死大鼠脑水肿和血-脑屏障通透性的影响

糖尿病合并脑梗死是糖尿病最常见、最严重的血管并发症。死亡率高。与非糖尿病性脑病相比，糖尿病脑梗死的发病率和死亡率是非糖尿病性脑病的2.4倍。脑梗死是由于脑动脉粥样硬化,使脑动脉管腔狭窄,血管内膜损伤,合并多种因素致局部血栓形成,加重脑动脉狭窄甚至完全闭塞,导致脑组织缺血缺氧和坏死,进而引起各种神经功能缺损的一种脑血管病。我们长期临床应用复元醒脑汤治疗脑梗死取得了显著的临床效果,为了进一步探讨复元醒脑汤对脑梗死治疗的作用机理,本实验拟在建立糖尿病脑梗死大鼠模型的基础上,观测复元醒脑汤对其神经功能缺损、脑组织含水量、血-脑通透性改变的干预作用。1实验材料1.1实验动物及其他选用120只SPF级雄性SD大鼠,体重(200±20)g,购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司,饲养于上海中医药大学附属龙华医院科技楼实验动物中心,动物合格证号:SCXK(沪)2011-009。1.2生物粉使用剂量复元醒脑汤,药物组成:人参10g(单煎)、三七10g、石菖蒲12g、水蛭10g、益母草30g、生南星15g、制大黄9g(后下),由本院制剂室生产提供,浓度为388g生药/L。1.3siga-aldricau2004FA2004B电子天平,上海精密科学仪器有限公司;大鼠脑立体定位仪,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;STZ,Sigma-AldrichInc(USA);凝血酶,Sigma-AldrichInc(USA);恒宇电热恒温鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂;紫外分光光度计,美国贝克曼库尔特公司生产。2实验方法2.1模型准备2.2大鼠脑梗死超早期手术的分组在常规适应性分笼喂养后按照正常组24只、糖尿病模型组96只进行随机分组,糖尿病模型组采用STZ腹腔注射法制糖尿病模型,造模成功后,连续高脂饮食饲养2周,再从中随机选取72只大鼠按糖尿病脑梗死模型组(简称模型组)24只、糖尿病脑梗死假手术组(简称假手术组)24只、糖尿病脑梗死治疗组(简称治疗组)24只进行随机分配,其余24只作为糖尿病组。完成造模后,治疗组每日按10.4g/kg体重,2次/d给予复元醒脑汤灌胃(参照陈奇主编《中药药理实验方法学》依实验动物与人体表面积比计算),模型组、假手术组、糖尿病组和正常组予等容量的生理盐水灌胃,连续饲养7d。2.3观察指标和方法2.3.1神经缺损及阻力治疗后每组随机选取12只大鼠进行评分(根据Bederson等神经缺损行为体征评分法):轻提鼠尾,使其头部高于地面10cm,正常大鼠两侧前爪前伸。0级(0分):无明显神经缺损症状;Ⅰ级(1分):梗死对侧前肢回收屈曲内收,同侧前肢向地面伸展;Ⅱ级(2分):Ⅰ级体征+俯卧于桌面时从梗死侧向对侧推动大鼠时阻力降低;Ⅲ级(3分):Ⅰ级体征+Ⅱ级体征+大鼠行走时向梗死对侧肢体旋转(呈追尾状)甚至倾倒。分值≥1分,为模型制作成功。2.3.2脑含水量检测脑组织含水量采用干湿脑重法测定。中药灌胃治疗7d后,每组随机选取6只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛麻醉后处死,迅速断头开颅取脑,取血肿周围脑组织约100mg(各组取相应部位脑组织),用电子天平先称取湿重,然后放入电热恒温鼓风干燥箱在100℃下烘烤24h至恒重再称取干重,脑组织含水量计算公式:脑组织含水量=(湿脑重-干脑重)/湿脑重×100%。2.3.3pcr和cu中药灌胃治疗7d后,每组各取6只大鼠,10%水合氯醛腹腔注射麻醉,在腹股沟处切开皮肤暴露股静脉,注入2%伊文思蓝(20mg/kg)循环20min,迅速剪开肋骨暴露出心脏,将灌注针头插入左心室,用动脉夹夹闭降主动脉,然后在右心耳处剪口,快速从左心室灌注生理盐水总量约100mL,至右心耳流出无色液体后,迅速开颅取脑。各组均摘取相应部位血肿脑组织,称重后浸入甲酰胺中,在54℃恒温水浴箱中孵育48h后,以3500r/min转速离心15min,将取其上清液置于紫外分光光度计(λ=632nm)下进行光密度值(OD)测定。脑组织中伊文思蓝含量以OD/g湿脑组织表示,以伊文思蓝含量(OD/g)代表脑血管通透性。2.4统计学处理方法应用SPSS18.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示,组间均数比较采用独立样本t检验;等级资料采用Ridit分析。检验效能以P<0.05为差异具有显著性,P<0.01为差异具有非常显著性。3结果3.1表1显示了神经缺损综合征的评分3.2大鼠颈内动脉血流试验制备糖尿病大鼠模型:将STZ试剂溶于pH为4.6的柠檬酸钠缓冲液中(现配现用),大鼠接受腹腔注射STZ试剂(50mg/kg),1周后成模(血糖>16.7mmol/L),并连续高脂饮食饲养2周。实施自体血栓栓塞性大鼠脑梗死模型手术。(1)制作血栓:将模型组、治疗组两组糖尿病大鼠用3%戊巴比妥钠液按0.15mL/100g剂量麻醉后,暴露股静脉,抽取静脉血0.5mL加入预先加有75U凝血酶的EP管中,立即混匀。然后用注射器吸取沉淀部分注入2根头皮针塑料管内,静置15min再打进盛有生理盐水的培养皿中,洗掉凝血块表面的红细胞。在显微镜下选择富含纤维素(深色)的血栓剪切成1～2mm的小段,再转入pH为7.4的PBS缓冲液中恒温(37℃)静置5h使其凝缩,吸入EP50管中备用。(2)制作脑梗死模型:将大鼠按前法麻醉后用眼科镊子钝性分离出左侧颈总、颈内、颈外动脉。结扎颈外动脉,用动脉夹夹闭颈总动脉和颈内动脉,用提前制备好的1毫升注射器针头(将针头处折一个90°的平钩)在颈外动脉上挑刺出一个小口。将吸入血栓的EP50导管由颈外动脉插入颈内动脉,松开颈内动脉上的动脉夹。缓慢将血栓注入颈内动脉,用生理盐水冲管后拔出EP50导管,结扎颈外动脉近心端。松开颈总动脉夹,缝合肌肉和皮肤。假手术组不将导管插入颈外动脉,其余操作与手术组相同,手术过程中控制动物肛温在(37±0.5)℃。4从“血脑梗死”看复元部分糖尿病并发脑梗死,多见于中老年人,中医学范畴为“消渴病”合并“中风”。《素问·上古天真论》云:“女子七七”、“男子七八”,“天癸竭”,肾精亏虚合并形神俱伤可为本病的发病基础。元代医家沈金鳌认为“元气虚为中风之根”,而消渴病患者往往病情迁延日久,脏腑功能衰竭,津亏无以濡养,元气生化乏源,痰瘀等病理产物“应运而生”。痰瘀互阻堵塞脉络,导致经筋气血运行不畅,日久化火生风,风火相煽,遂发为“中风”。患者临床多表现为头痛眩晕、言语謇涩、肢体麻木、手足拘急、骤然昏仆、半身不遂等。我们在长期临床研究中总结发现,脑梗死的病因主要以元气虚损为根本,痰瘀互结、痰热生风为病机核心。痰、瘀为元气亏虚导致的中间病理产物,是贯穿中风始终的病机特点,痰瘀互阻从而致使化风生热,风火相煽,乃发“中风”。据此,我们采取扶持元气为主,佐以逐瘀化痰、泄热息风、醒脑开窍之法,以自拟复元醒脑汤(人参、水蛭、天南星、大黄、三七)治疗脑梗死,取得良好临床疗效。而且在既往临床研究中发现,复元醒脑汤用于治疗脑梗死能明显提高临床疗效,降低病死率,减轻脑水肿以及改善患者神经功能。脑水肿是急性脑血管疾病常见严重病理变化之一,主要表现为脑容积变大,颅内压升高。脑缺血后再灌注发生时,防御系统骤然受损,自由基迅速升高弥散,过度灌注会严重损伤脑血管内皮细胞,并对微血管结构造成破坏,血脑屏障即被破坏,毛细血管通透性随之增高,大量大分子蛋白质渗入血管间质,继而可导致脑水肿发生。脑水肿出现之后脑组织的含水量必然增加,故测定脑组织含水量至今仍是反映脑水肿严重程度的重要指标。血-脑屏障位于血液与脑、脊髓的神经细胞之间,由脑血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜构成。脑的毛细血管属于连续型,毛细血管内皮细胞之间以紧密连接封闭,内皮外有基板、周细胞及星形胶质细胞突起的脚板围绕。脑和脊髓在血-脑屏障的保护下能免受内、外环境各种物理、化学因素的影响,而维持相对稳定的状态。在血-脑屏障损伤(如炎症、外伤、血管病)时,血-脑屏障通透性发生改变,导致脑水肿、脑出血等严重后果,相关研究证实脑组织含水量的变化与血-脑屏障通透性呈正相关。本实验结果证实糖尿病脑梗死模型组大鼠出现明显的神经体征缺损,术后活动能力明显减退,血-脑屏障的通透性显著升高,脑组织含水量明显增加,表明脑水肿在脑梗死发生及病情发展过程中扮演着重要角色,而且脑水肿的发生发展与血-脑屏障通透性的升高密切相关。而且复元醒脑汤可以有效保护血-脑屏障,减少再灌注损失对其造成的二次破坏,降低血-脑屏障通透性,降低糖尿病脑梗死大鼠脑组织含水量,减轻脑水肿对大鼠术后恢复的不良影响。这就