翻译水平的调节课件

四、翻译水平的调节

翻译水平的调节翻译水平的调节遗传密码的性质翻译水平的调节通过校正tRNA的方式校正基因的碱基缺失和插入翻译水平的调节为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称。催化DNA链断开和结合的偶联反应，为了分析体外反应机制，用环状DNA为底物。在闭环状双链DNA的拓扑学转变中，要暂时的将DNA的一个链或两个链切断，根据异构体化的方式而分为二个型。切断一个链而改变拓扑结构的称为Ⅰ型拓扑异构酶（top-oisomeraseⅠ），通过切断二个链来进行的称为Ⅱ型拓扑异构酶（topoisomeraseⅡ）。属于Ⅰ型的拓扑异构酶，有大肠杆菌的ω蛋白（ω-protein，由分子量11万的单个多肽链所成）及各种真核细胞中存在的切断-结合酶（nicking-closingenzyme，分子量约6万5千—7万的及分子量约10万的）。Ⅱ型拓扑异构酶，有存在于细菌中的DNA促旋酶、噬菌体T4的拓扑异构酶Ⅱ以及真核细胞中依赖ATP的拓扑异构酶Ⅱ等。

翻译水平的调节翻译水平的调节在Ⅱ型拓扑异构酶中，DNA促旋酶可单独催化闭环状DNA产生超螺旋，这是独特的。

翻译水平的调节(一)

翻译内含子(translationalintron)翻译水平的调节

T4DNA拓扑异构酶在ATP存在下，可使超螺旋DNA变成松散的DNA，其中有DNA双链的断裂，链的旋转，再缝合。全酶由三种亚基六个蛋白质分子组成，分别由基因39、基因52和基因60编码。基因39编码的亚基有520个氨基酸，ATP酶活性。基因52编码的亚基有441个氨基酸，松散DNA超螺旋。基因60编码的亚基有160个氨基酸，结合各亚基，协调功能。这三个亚基的蛋白质顺序已分析清楚。已经获得基因39、52、60的DNA克隆，并在大肠杆菌中高效表达蛋白质。翻译水平的调节T4DNAtopoisomerase:anewATP-dependentenzymeessentialforinitiationofT4bacteriophageDNAreplicationNature281,456-461(11October1979)

LeroyF.

Liu,Chung-Cheng

Liu

&

BruceM.

AlbertsDepartmentofBiochemistryandBiophysics,UniversityofCalifornia,SanFrancisco,California94143翻译水平的调节NucleotidesequenceofatypeIIDNAtopoisomerasegene.BacteriophageT4gene39NucleicAcidsResearch,1986,Vol.14,No.197751-7765WaiMunHuangDepartmentofCellular,ViralandMolecularBiology,UniversityofUtahMedicalCenterSaltLakeCity,UT84132,USA

翻译水平的调节The52-proteinsubunitofT4DNAtopoisomeraseishomologoustothegyrA-proteinofgyrase.NucleicAcidsRes.1986September25;14(18):7379–7390.WMHuang翻译水平的调节对基因60的核苷酸序列分析后，难以排出合适的阅读框架，与它表达产物蛋白质的氨基酸顺序对照，发现在第46位甘氨酸和第47位亮氨酸密码子之间，有50个核苷酸插入，其中紧跟第46位甘氨酸密码的是一个终止密码TAG。

DNA有义链5’－GGCTAG

‥‥‥CTC－3’mRNA5’－GGCUAG‥‥‥CTC－3’

蛋白质序列‥‥甘氨酸亮氨酸‥

第46位第47位

翻译水平的调节

在细胞中，mRNA中是否也有这段插入序列？

人工合成基因60编码区的30聚多核苷酸和插入序列的30聚多核苷酸作为两种探针，分别检测T4感染细胞的RNA，杂交分析，两种探针完全给出相同的杂交图谱一条带，实际上细胞中只有一种RNA，没有发现有mRNA剪切加工的现象。对细胞中基因60的mRNA作核苷酸序列分析，都发现有50核苷酸插入序列的存在。翻译水平的调节RNA电泳转移杂交分析正极负极共三条带编码区探针插入序列探针DNA转录剪接+翻译水平的调节无论哪种探针都只有一条相同的带，说明细胞中只有一种RNA翻译水平的调节普遍性：

1.将50个核苷酸序列插入到LacZ的适当编码序列内，在翻译过程中，大肠杆菌核糖体同样可以跳过这个非翻译序列，产生完整的β半乳糖苷酶。2.在酵母表达系统中，酵母核糖体也能跳过这段序列，产生完整的蛋白质。翻译水平的调节意义：

设想在翻译水平上调控，形成不同的二级结构。翻译水平的调节Evaluationofthemutationssuggests5requirementsforefficientribosomehopping:Aminoacidresidues17to32ofthenascentpeptideTerminationcodonrightaftercodon47Ashorthairpinatthetake-offsiteIdentitybetweencodons47and48A50ntspacingbetweencodons47and48翻译水平的调节Science,Vol239,Issue4843,1005-1012,

1988ApersistentuntranslatedsequencewithinbacteriophageT4DNAtopoisomerasegene60WMHuang,SZAo,SCasjens,ROrlandi,RZeikus,RWeiss,DWinge,andMFangDepartmentofCellular,ViralandMolecularBiology,UniversityofUtahMedicalCenter,SaltLakeCity84132

翻译水平的调节abstractA50-nucleotideuntranslatedregionisshowntobepresentwithinthecodingsequenceofEscherichiacolibacteriophageT4gene60,whichencodesoneofthesubunitsforitstypeIIDNAtopoisomerase.ThisinterruptionispartofthetranscribedmessengerRNAandappearsnottoberemovedbeforetranslation.Thus,theusualcolinearitybetweenmessengerRNAandtheencodedproteinsequenceapparentlydoesnotexistinthiscase.Theinterruptionisbracketedbyadirectrepeatoffivebasepairs.Amechanismisproposedinwhichfoldingoftheuntranslatedregionbringstogethercodonsseparatedbytheinterruptionsothattheelongatingribosomemayskipthe50nucleotidesduringtranslation.Thealternativepossibility,thattheproteinisefficientlytranslatedfromaveryminorandundetectableformofprocessedmessengerRNA,seemsunlikely,buthasnotbeencompletelyruledout.翻译水平的调节（二）microRNA翻译水平的调节（三）蛋白质合成过程的调节

1.珠蛋白合成调控-eIF2磷酸化对翻译的调控：

翻译水平的调节红细胞体积很小，直径只有7～8μm，形如圆盘，中间下凹，边缘较厚。它具有弹性和可塑性，在通过直径比它还小的毛细血管时，可以改变形状，通过后仍恢复原形。

正常成熟的红细胞没有细胞核，也没有高尔基体和线粒体等细胞器，但它仍具有代谢功能。红细胞内充满着丰富的血红蛋白，血红蛋白约占细胞重量的32％，水占64％，其余4％为脂质、糖类和各种电解质。翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节

哺乳动物网织红细胞蛋白质合成调控研究得较为详细。网织红细胞是红细胞成熟前发育的最后阶段，由它合成的蛋白质90％以上是珠蛋白。珠蛋白铁＋卟啉

血红素血红蛋白翻译水平的调节

血红素与珠蛋白的合成以平行速度进行，如完整细胞中缺铁或网织红细胞内缺血红素，合成蛋白质的速度下降到原来的10％。翻译水平的调节血红素缺乏造成的影响是生成了一个抑制物血红素调控阻遏物(HCR)。分子量80,000-90,000，含有蛋白激酶的性质，可磷酰化eIF-2，80S起始复合物不能形成，

加入外源的eIF-2或HCR抗体可克服HCR的影响。有一种专一性的磷酸酶可以催化这个逆反应。翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节2.酵母eIF-2的磷酸化对GCN4mRNA翻译起始的激活作用翻译水平的调节啤酒酵母的GCN4是一个转录因子，它能特异地结合与许多氨基酸合成酶基因的启动子TGACTC上，诱导基因的转录。GCN4蛋白质合成量的增多是由于GCN4mRNA在翻译时被激活。翻译水平的调节翻译水平的调节上游的AUG起始密码子的存在抑制下游ORF的翻译在eIF-2正常水平时，上游的每个ORF都能进行翻译，GCN4的翻译几率较少翻译水平的调节在氨基酸饥饿的条件下，磷酸化的eIF-2增多，活化的eIF-2减少，翻译起始复合物的再循环必然受到限制。翻译完uORF1后的核糖体迅速滑过其它uORF，到达GCN4-ORF开始翻译，逃避了其它uORF的抑制。翻译水平的调节五、翻译后水平的调节

（一）蛋白质的成熟1.

多余序列的切除胰岛素原的激活翻译水平的调节2.

蛋白质内含子Intein

蛋白质内含子是蛋白质中的一段多肽链，靠自我剪切的方式从前体蛋白中分离出来，同时两端以肽键的方式相连。翻译水平的调节①特征序列

A、B、C、D、E、F、G六个保守的motif翻译水平的调节Ser类型②自我剪切过程翻译水平的调节

Cys类型翻译水平的调节用途构建表达载体，产生蛋白质。翻译水平的调节NEWENGLANDBioLabsINC.IMPACT-CNSystem翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节（二）蛋白质高级结构的正确形成:

分子伴侣

1.Anfinsen的牛胰核糖核酸酶变性复性试验

翻译水平的调节RNaseA

翻译水平的调节

50年代末完成全序列测定的第一个蛋白质，124个氨基酸，MW12600，4对二硫键。在8mol/L尿素，β-巯基乙醇存在时，二硫键被破坏，变为松散结构。透析，除去尿素和β-巯基乙醇，再加入氧化剂，则重新恢复构象。

翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节蛋白质自组装(Selfassembly)假说

第一阶段是成核（nucleation)。由于挤压效应或疏水作用，多肽链中的一些小肽段迅速行成螺旋，作为进一步折叠的核心，称为核区。第二阶段是折卷（collapse)。已成为核的结构，随后散落成为较大的超二级结构单元的集合体，包括一些β-折叠片和β-转角的形成。第三阶段是凝集（condensation)。上述集合体在原子水平上凝集，形成致密的三级结构。翻译水平的调节翻译水平的调节“这个实验出色地证明了蛋白质的功能取决于特定的天然构象，而规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列中。”摘自《基础生物化学》（高等教育出版社，2001.7)翻译水平的调节ChristianB.Anfinsen(USA)因此获得1972年诺贝尔生理或医学奖。翻译水平的调节问题：①特例

：RNase的超稳定性。翻译水平的调节②蛋白质的合成过程：蛋白质合成中，首先合成N端，再向C端延伸。在水相中，亲水的力量迫使多肽链疏水的基团聚集于内部，亲水基团位于外部。新生肽键的折叠在合成早期业已开始，随肽键的延伸同时进行折叠，形成某种结构。这与一条变形伸展的完整肽键的重折叠的情况是完全不同的。翻译水平的调节发现过程2.Molecularchaperone的发现过程及定义

翻译水平的调节

1962年，意大利生物学家F.M.Ritossa在研究果蝇(Drosophila)的发育时，发现:当培养果蝇的温度从正常的25℃上升到32℃时，幼虫(larvae)细胞中的一些巨型染色体上的新的位点变得异常活跃。研究表明，温度的升高促使一些新基因的表达。这就是热激反应（heat-shockresponse)的发现。翻译水平的调节定义Themolecularchaperoneconcept.

EllisRJ.

DepartmentofBiologicalSciences,UniversityofWarwick,Coventry,UK.

Molecularchaperonesareaubiquitousfamilyofcellularproteinswhichmediatethecorrectfoldingofotherpolypeptides,andinsomecasestheirassemblyintooligomericstructures,butwhicharenotcomponentsofthosefinalstructures.翻译水平的调节一类相互之间没有关系的蛋白质。它们的功能是帮助多肽结构的其它物质在体内进行正确的非共价的组装，并且不是组装完成的结构在发挥其正常的生物功能的组成部分。翻译水平的调节中国科学院生物物理研究所的王志珍院士翻译水平的调节分子伴侣帮助新生肽链正确折叠--助人为乐的分子伴侣太太很快出现在需要她尽力而为的场所（新生肽链的折叠，越膜，应激反应等情况），她主动去发现她应该帮助的正在成长的新生肽姑娘（识别折叠中间物），热情地伸出友谊之手（相互作用和结合），并发出警戒之言"不！不！别往哪儿走！"，防止她们误入歧途掉进不可自拔的死亡深渊（防止错误的相互作用导致的无效折叠和不可逆聚集），从而帮助她们沿着朝向正确目标的光明大道前进（有利于有效折叠成功能蛋白的正确折叠途径）。新生肽姑娘健康地成长（正确折叠）。折叠好的蛋白质小姐愉快地，昂首阔步地准备去做自己的贡献（折叠成特定的空间构并获得生物活性的功能蛋白）。翻译水平的调节3.分子伴侣的种类

a.分子内分子伴侣

intramolecularchaperone

体内许多蛋白质都以前导肽的前体形式合成，前导肽在蛋白质折叠中具有分子伴侣的功能。b.分子伴侣翻译水平的调节分子伴侣的分类和分布分类种属细胞内的定位核质蛋白家族Nucleoplasmin真核生物细胞核基质ProteinXLNO-38真核生物细胞核基质NuleoplasminS真核生物细胞核基质Hsp70Hsp70(Hsp40、Hsp24)所有生物细胞质和细胞骨架，热休克后移至细胞核及核仁质膜上；哺乳动物线粒体DnaK(DnaJ、GrpE)大肠杆菌细胞质Ssa1-4SsB1SsC1SsD1酵母细胞质和线粒体Bip哺乳动物内质网Hsp60家族GroEL(GroES)大肠杆菌细胞质Cpn60(cpn10)真核细胞线粒体和叶绿体基质RBP植物叶绿体翻译水平的调节分类种属细胞内的定位TCP-1家族TF55古细菌细胞质Tric(TCP-1）真核生物细胞质Hsp90家族Hsp90哺乳动物细胞质Hsp83,Hsp87酵母和果蝇细胞质Grp94哺乳动物内质网Hsp100家族Hsp104酵母细胞质和核、核仁中ClpX大肠杆菌细胞质翻译水平的调节1)伴侣素家族（chaperonin,Cpn）

Cpn家族是具有独特的双层7-9元环状结构的寡聚蛋白（Hemminngwen1988;Cheng1989），它们以依赖ATP的方式促进体内正常和应急条件下的蛋白质折叠。Cpns又分为两组：GroEL(Hsp60)家族和TriC家族。GroEL型的Cpns存在于真细菌、线粒体和叶绿体中，由双层7个亚基组成的圆环组成，每个亚基分子量约为60Ku。它们在体内与一种辅助因子，如E.coli中的GroES，协同作用以帮助蛋白折叠。除了叶绿体中的类似物外，这些蛋白是应急反应诱导的。人们对GroEL和GroES的结构、功能及其作用机制做了十分详尽的研究。TRiC型（TCP-1环状复合物）存在于古细菌和真核细胞质中，由双层8或9元环组成，亚基分子量约为55K，与小鼠中TCP-1尾复合蛋白（TCP-1tailcomplexprotein）有同源性。这种Cpn没有类似GroES的辅助因子，而且只有古细菌中的成员有应急诱导性；翻译水平的调节ThestructureofE.coliGroELheatshockprotein(hsp).Thereare14subunitsoftheGroEL.AttachedtotheapicaldomainistheGroES.Theapicalregionisalsocapableofpolypeptidebinding.Thelowerregion,(circled,bottom)isconcernedwithATPbinding.翻译水平的调节GroEL/GroES复合体的高级结构翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节2)应激蛋白70家族(Stress-70family)又称为热休克蛋白70家族（Hsp70family），是一类分子量约70Ku的高度保守的ATP酶，广泛地存在于原核和真核细胞中，包括大肠杆菌胞浆中的DnaK/DnaJ，高等生物内质网中的Bip、Hsc1、Hsc2、Hsc4或hsc70，胞浆中的Hsp70、Hsp68和Ssal4p，线粒体中的Ssclp、Hsp70等。在细胞应急和非应急条件下的蛋白质代谢，如蛋白质的从头折叠（denovoproteinfolding)、跨膜运输、错误折叠多肽的降解及其调控过程中有重要的作用。在体内，Hsp70家族成员的主要功能是以ATP依赖的方式结合未折叠多肽链的疏水区以稳定蛋白质的未折叠状态，再通过有控制的释放帮助其折叠（Hartl1996）。翻译水平的调节3)应激蛋白90家族(Stress-90family)即热休克蛋白90家族（Hsp90family），分子量在90Ku左右，包括大肠杆菌胞浆中的HtpG，酵母胞浆中的Hsp83与Hsc83，果蝇胞浆中的Hsp83，以及哺乳类胞浆中的Hsp90与内质网中的Grp94（Erp90或内质网素endoplasmin）等。Hsp90可以与胞浆中的类固醇激素受体结合，封闭受体的DNA结合域，阻碍其对基因转录调控区的激活作用，使之保持在天然的非活性状态，但hsp90的结合也使受体保持着对激素配体的高亲和力。hsp90还与Ras信号途径中许多信号分子的折叠与组装密切相关，主要是hsp90的结合与解离，介导了这些分子在非活性形式与活性形式间的转化。如转化型酪氨酸激酶pp60v-src或在一定条件下，从hsp90等与之形成的复合物中释放，才能转位至胞膜，行使激酶的活性功能。Casein(CKII)和el/f-2a是两种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其中Casein(CKII)与细胞生长和细胞周期有关，el/f-2a激酶则调节蛋白质合成，两者均可与hsp90及其他分子伴侣形成复合物。除hsp90以外，其他分子伴侣如hsp70,PPIs等都影响了受体分子的激活过程。翻译水平的调节4)其他种类的分子伴侣包括核质素、T受体结合蛋白(TRAP)、大肠杆菌的SecB和触发因子（triggerfactor）及PapD、噬菌体编码的支架蛋白（scaffoldingproteins）等。分子伴侣不仅与胞内蛋白的折叠与组装密切相关，影响到蛋白质的转运、定位或分泌；而且与信号转导中的信号分子的活性状态与活性行为相关连，具有重要的生理意义（Bohen1995,Pratt1997）。翻译水平的调节c.酶

1)肽基脯氨酸顺反异构酶

Peptidylprolylisomerases(PPIases)acceleratecis-transisomerizationofProresiduesduringproteinfolding.

翻译水平的调节翻译水平的调节2)蛋白质二硫键异构酶?

真核生物的PDI主要位于内质网，细菌中的类似物是Dsb家族，位于细菌外周质（periplasm），通过催化巯基与二硫键的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）。在蛋白质折叠过程中，主要催化含有二硫键的膜蛋白或分泌蛋白的正确折叠。

翻译水平的调节翻译水平的调节4.分子伴侣的作用机制

Example：ChaperoneringsinproteinfoldinganddegradationArthurL.Horwich

,EilikaU.Weber-Ban,andDanielFinleyPNASVol.96,Issue20,11033-11040,September28,1999

翻译水平的调节翻译水平的调节返回翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节ProteinfoldingwithintheER

翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节5.分子伴侣的功能翻译水平的调节蛋白质和新生肽的折叠模型新生肽链未折叠肽链复合物中介降解产物正常功能的蛋白质Aggregates无效的错误折叠正确折叠释放伴侣分子并折叠被降解识别并结合分子伴侣翻译水平的调节

由于许多蛋白质的高级结构的形成需要分子伴侣，所以其生物学功能广泛。a.α-crystallin眼睛晶状体的主要结构蛋白，与其它晶状体蛋白结合以防止它们老化和沉淀，保持晶状体澄清和必要的折光度。b.Hsp60.Hsp70帮助蛋白质进入线粒体。翻译水平的调节c.SecBE.coli中维持新生肽的疏松状态使其可以穿过质膜而运输。d.PapD

位于细菌间质中，与P鞭毛蛋白亚基结合防止它们在周质中聚合，从而促进正确组装P鞭毛。e.Rb.

视网膜母细胞瘤抑制基因是某些转录因子的分子伴侣。翻译水平的调节疯牛病、老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤、白内障等等都是“折叠病”。

翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节Prion翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节蛋白质合成：蛋白质氨基酸翻译水平的调节翻译水平的调节第二十一种蛋白质氨基酸：硒代半胱氨酸Selenocysteine（Sec

）翻译水平的调节Severalenzymes(forexample,glutathioneperoxidase谷胱甘肽过氧化酶(GSHPx)

,tetraikiodothyronine5'deiodinaseandformatedehydrogenase)containtheunusualaminoacid翻译水平的调节翻译水平的调节由UGA编码Sec，在动物(猫、牛和鼠等)和大肠杆菌中发现

翻译水平的调节甲状腺分泌甲状腺激素，调控体内各种化学反应的速度（代谢速率）。甲状腺通过两种方式影响机体代谢率：刺激几乎所有组织合成蛋白质；增加细胞耗氧量，细胞负担加重，器官代谢加快。

翻译水平的调节翻译水平的调节甲状腺激素存在方式有两种：一种是甲状腺素（T4），在甲状腺内产生，存在时间短，对机体代谢率影响较小。T4在肝脏及其他脏器转化为有代谢活性的另一种形式甲状腺激素，叫三碘甲状腺原氨酸（T3）。约80％有活性的激素在T4的转化过程中产生，剩余20％由甲状腺自身产生。

翻译水平的调节T4的脱碘反应是由脱碘酶的催化完成

翻译水平的调节I型脱碘酶的cDNA序列和蛋白一级结构

翻译水平的调节三种脱碘酶都是含硒酶

翻译水平的调节脱碘机理翻译水平的调节第二十二种蛋白质氨基酸：翻译水平的调节翻译水平的调节甲烷菌分解甲氨(CH3NH2)，而产生甲烷。翻译水平的调节October16,2002Identificationofthe22ndgenetically-encodedaminoacidinamethanogenmethyltransferaseG.Srinivasan,T.K.Ferguson,C.M.James,B.Hao,W.Gong,J.Krzycki,andM.Chan

OhioStateUniversity,Columbus,Ohio翻译水平的调节翻译水平的调节甲胺甲基转移酶翻译水平的调节Proteinshavelongbeenknowntobecomposedofonly20buildingblocks,calledaminoacids.Butabout25yearsago,scientistsdiscoveredanadditional,21staminoacid,calledselenocysteine.Now,twogroupsofresearchersledbybiochemistMichaelChanandmicrobiologistJosephKrzycki,bothofTheOhioStateUniversityinColumbus,haveidentifiedthe22ndaminoacidinanenzyme,calledmethyltransferase,whichbreaksdownmethylamine(CH3NH2)inmethane(CH4)-producingmicrobescalledmethanogens,leadingtotheproductionofmethane.Thescientistscallthisnewaminoacidpyrrolysine.

翻译水平的调节翻译水平的调节吡咯赖氨酸：Pyl

翻译水平的调节密码子为UAG翻译水平的调节吡咯赖氨酸在产甲烷菌的甲胺甲基转移酶中发现,是目前已知的第22种参与蛋白质生物合成的氨基酸,与标准氨基酸不同的是,它由终止密码子UAG的有义编码形成.与之对应的在产甲烷菌中也含有特异的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶(PylRS)和吡咯赖氨酸tRNA(tRNAPPy1).tRNAPy1具有不同于经典tRNA的特殊结构.产甲烷菌通过直接途径和间接途径这两种途径生成吡咯赖氨酰-tRNAPy1(Pyl-tRNAPy1),它还可能通过mRNA上的特殊结构以及其他还未发现的机制,控制UAG编码成为终止密码子或者吡咯赖氨酸。翻译水平的调节相关基因pylT：编码了一特殊的tRNACUA

。

pylS：编码一种合成酶(LysRS)，能将赖氨酸结合到

tRNACUA

上形成赖氨酸氨酰-tRNACUA

。

pylB和pylC：赖氨酸氨酰-tRNACUA

被修饰为吡咯赖

氨酸氨酰-tRNACUA。翻译时吡咯赖氨酸氨酰-tRNACUA

携带的吡咯赖氨酸被结合到蛋白质链。过程中并没有显示本应出现的终止翻译的（UAG）作用。

翻译水平的调节1.Hao,B.,W.Gong,T.Ferguson,C.James,J.Krzycki,andM.Chan.“ANewUAG-EncodedResidueintheStructureofaMethanogenMethyltransferase”,Science,2002,296,1462-1466.2.Srinivasan,G.,C.James,andJ.Krzycki“PyrrolysineEncodedbyUAGinArchaea:ChargingofaUAG-DecodingSpecializedtRNA”,Science,2002,1459-1462.翻译水平的调节还可不可能产生

新的蛋白质氨基酸？翻译水平的调节需要哪些条件？翻译水平的调节

氨酰－tRNA合成酶,Mg2+AA+tRNA+ATP======氨酰-tRNA+AMP+PPi翻译水平的调节tRNAGlnGln-tRNAsynthetaseAminoacidarmAnticodonarmATPCrystalstructureofGln-tRNAsynthetasecomplexedwithitscognatetRNA翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节会产生更多的蛋白质氨基酸吗？对细胞或生物有哪些影响？翻译水平的调节有哪些用途？美国斯克里普斯研究所和加利福尼亚伯克利分校的研究小组通过改变大肠杆菌的基因，使大肠杆菌能够产生一种叫做“对氨苯丙氨酸”的新型氨基酸。翻译水平的调节（三）真核生物蛋白质的定向输送翻译水平的调节运往线粒体中的蛋白质翻译水平的调节（四）蛋白质降解的调节：

泛肽－蛋白酶系统

细胞周期蛋白的消失翻译水平的调节ProteinsdiffermarkedlyintheirhalflivesandaretargetedfordestructionDamagedproteinsareusuallyquicklyremovedbycontrolleddegradation;Enzymesimportantinmetabolicregulationusuallyhaveshortlives;ProteinsaredegradedbyATP-dependentcytosolicsystemsinallcells;Ubiquitin,aextremelywellconserved76-residueprotein,tagsproteinsfordestructionineukaryoticcellsbytheactionofthreeenzymes(E1,E2andE3);翻译水平的调节

2004年诺贝尔化学奖得主翻译水平的调节翻译水平的调节1.哺乳动物泛肽的结构与特征MQIVFKTLTGKTITLEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVIRLRGG翻译水平的调节

2.泛素－蛋白酶作用过程

翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节1)在ATP存在下，泛素活化酶(ubiquitin-activatingenzyme)E1催化泛素羧基末端腺苷酸化，然后这个活化的泛素以羧基端的甘氨酸(G)与E1上的一个半胱氨酸之间形成硫酯键，这是一个高能键。2)在E1和泛素偶联酶(ubiquitin-confugatingenzyme)EZS家族之一的催化下，将泛素仍以硫酯键连接于E2上，接着，在E2和泛素－蛋白连接酶(ubiquitin-proteinligase)E3的催化下，泛素从E2转移到降解的蛋白质的赖氨酸上形成酰胺键。这种泛素与蛋白质的复合物是一个蛋白酶复合体的作用目标，这个蛋白酶复合体由多条肽链组成，降解泛素－蛋白酶复合物为多肽，降解过程可能需要ATP供能，最后由泛素水解酶水解时放出游离的泛素再参加下一次循环。翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节第二节

酶的活性调节

一、变构效应的调节（一）变构酶的特性与结构变构酶特点：a.有多个亚基b.有四级结构c.除了有可以与底物结合的活性中心外，还有可以结合调节物的别构中心d.酶促反应动力学不遵循米氏方程翻译水平的调节（三）变构酶调节催化活性的机理(略)

（四）变构酶举例：

a.大肠杆菌天冬氨酸转氨甲酰酶－ATCase.6个调节亚基R，上面有结合ATP和CTP部位；6个催化亚基C，具催化活性。ATP激活剂，CTP抑制剂。翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节Catalytictrimersaregreen.

Regulatorydimersarered.翻译水平的调节翻译水平的调节（二）变构酶的酶促反应动力学根据结合调节物后构象的变化对酶与底物结合的影响，分为正协调效应与负协调效应。a.非调节酶b.正协同别构酶：在中等或较低底物浓度下，底物浓度发生较小的变化引起酶促反应速度有较大的变化，可以灵敏的调节酶促反应速度。c.负协同别构酶：在很宽的底物浓度范围内，酶促反应速度变化不明显，即对底物浓度变化不敏感。翻译水平的调节翻译水平的调节b.3－磷酸甘油醛脱氢酶：负协同效应别构酶代表

此酶具有四个亚基，可以和四个NAD＋结合，但结合常数不同。酶结合NAD＋后，发生构象变化。NAD＋和酶结合的解离常数很小，因此虽然底物NAD＋浓度很低，也能顺利地和酶结合。但是当NAD＋浓度升高时，酶结合了两个NAD＋之后，再结合第三、第四个NAD＋就不那么容易。也就是说这时候再要提高酶反应速度是较难的，需要浓度大大提高才行。在一定的底物浓度范围内，底物浓度变化不足以影响酶反应速度。这就是负协同别构酶对底物浓度变化的不敏感性。翻译水平的调节翻译水平的调节D-glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase

(holoform)(E.C.1.2.1.12)complexedwithNAD(red)翻译水平的调节3-磷酸甘油醛脱氢酶与NAD＋结合的解离常数(平衡透析测定)

解离常数(mol/L)

虾肌兔肌

K1

<5×10-9

<10-10

K2

<5×10-9

<10-9

K3

6×10-7

3×10-7

K4

1.3×10-6

2.6×10-6

翻译水平的调节在有机体中有许多需要NAD＋的代谢途径，NAD+参与许多的反应，其浓度波动大。糖酵解是生物体内重要的代谢过程，速度要求相对稳定，在供氧不足的情况下，它仍需以一定的速度稳定的进行反应。因为3-磷酸甘油醛脱氢酶为此过程的负协同别构酶，对底物NAD＋浓度变化不敏感，所以当NAD＋浓度很低(缺氧情况下)，其它需要NAD＋的代谢反应都随之减缓时，酵解过程仍然能以一定的速度顺利的进行。由此可以看到负协同效应别构酶的重要生理功能。翻译水平的调节翻译水平的调节二、同功酶的调节（一）同功酶的定义及形成

同功酶(isoenzyme)是能催化相同的化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、理化作用不完全相同的一组酶。它们普遍存在于动植物和微生物中，至今已发现了数百种之多，同功酶可存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织、同一细胞中。初级同功酶：

酶蛋白由不同的基因编码而产生。次级同功酶：由一个酶蛋白的基因在表达过程中经过不同的加工和修饰所产生。翻译水平的调节（二）意义：1.

生物不同部位的生理状况2.

在发育过程中，适应不同的发育阶段3.

分枝代谢的调节

翻译水平的调节三、酶分子的共价修饰

在某种酶的催化下，某一基因(磷酰基或腺苷酰基)以共价键与酶分子相连，使酶活性发生改变。主要指蛋白质的磷酸化与脱磷酸化翻译水平的调节蛋白质的共价修饰

乙酰化：N末端的

－氨基和赖氨酸的ε－氨基甲基化：

－氨基、ε－氨基：精氨酸的胍基以及C末端的

－羧基和侧链羧基上磷酸化：丝氨酸、苏氨酸、

酪氨酸的羟基上泛素化：

－氨基和ε－氨基上糖基化：

N－糖苷链连接于天门冬酰胺的酰胺基上

O－糖苷键：丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸、羟脯氨酸的羟基上

S－糖苷键：半胱氨酸的巯基翻译水平的调节翻译水平的调节（一）概念及特性蛋白质的磷酸化与脱磷酸化过程是生物体内存在的一种普遍的调节方式，几乎涉及所有的生理及病理过程，如糖代谢、光合作用、细胞的生长发育、基因表达、神经递质的合成与释放、甚至细胞的病变，在细胞的信号传递过程中有着极其重要的作用。蛋白质的磷酸化是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP的γ位的磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆反应由蛋白磷酸酶催化，称为脱磷酸化。翻译水平的调节特性：ATP在大多情况下是磷酸基团的供体。蛋白质中被磷酸化的氨基酸残基主要是Ser或Thr，有些蛋白激酶可磷酸化酪氨酸。被磷酸化的氨基酸残基可以有多个。多数蛋白激酶表现出一定的底物特异性，但很少有绝对特异性。一种蛋白质可作为几种蛋白激酶的底物和一种蛋白激酶有多种底物的情况是很常见。但一般情况下各类蛋白激酶都有它们的适宜的底物。翻译水平的调节翻译水平的调节Glucose(red),AMP(darkblue,allostericactivator),pyridoxalphosphate(PLP,B6derivative,lightblue),andser14(yellow)Glycogenphosphorylase翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基附近的氨基酸组成和顺序常常构成被蛋白激酶辨认的特殊区域。例如依赖cAMP的蛋白激酶(PKA)需要底物被磷酸化的丝氨酸或苏酸残基附近(N－端方向)由碱性氨基酸即Arg或

Lys残基，如－Arg-Arg-X-Ser/Thr-x这样的顺序，其中X可以是任何氨基酸残基。在丝氨酸/苏氨酸类型的蛋白激酶中，由第二信使调节的蛋白激酶都需要底物具有类似的结构，而这类蛋白激酶中非信息依赖性的酪蛋白激酶则需要底物被磷酸化的氨基酸残基C端附近要有酸性氨基酸残基，即具有类似－X-X-Ser/Thr-X-Glu-的结构顺序。酪氨酸型的蛋白激酶有时需要被磷酸化氨基酸残基附近要有酸性氨基酸，但是不是所有这类蛋白激酶都需要这样的底物结构尚不清楚。翻译水平的调节（四）蛋白质磷酸化的意义

1．催化蛋白质磷酸化的蛋白激酶的活性受胞内信使cAMP，

Ca2+，DG等的调控，也即其活性主要受胞外信号的间接调节，是细胞对外界的信号作出反应，所引起的细胞效应，许多是持久的，如细胞的分裂分化等过程。翻译水平的调节2．调节细胞内已存在的酶的“活性酶量”。与酶的重新合成与分解相比，这种方式是细胞对外界刺激作出迅速反应。肌肉中，糖原磷酸化酶

糖元

G-1-P糖元利用的第一步，也是糖元降解利用的主要调节机制。动物体内，两种状态a.(四聚体，激活)

b.(二聚体，失活)翻译水平的调节3．对外界信号具有级联放大作用。胰高血糖素升高血糖的机理。翻译水平的调节翻译水平的调节4．蛋白质磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有的生理过程，功能上具有多样性。除了其主要功能之一调节酶的活性以外，从磷蛋白在胚胎发育中的营养作用到细胞的生长发育、分裂分化调控、基因表达甚至癌变，都有这一过程的参与。调节的对象，可以是酶类、功能蛋白、结构蛋白、各种受体等。最近人们还发现一种非常有趣的现象，在某种情况下，已知具有一定生理功能的某些蛋白质可被磷酸化，但磷酸化的结果对其功能并没什么明显影响，这种情况被称为“哑态”磷酸化，后来发现，这些被磷酸化的蛋白质常常是蛋白水解酶的“靶子”而被降解。因此磷酸化作用还可能参与活性分子的“灭活”而作为某些生理过程的调节方式。翻译水平的调节5．蛋白激酶的自身磷酸化

(autophosphorylation)几乎所有的蛋白激酶都可以进行自身的磷酸化作用，即某种蛋白激酶可以利用它自身作为底物。这种作用可以发生在酶分子之间，两个酶分子之间可以相互磷酸化；也可发生在分子的内部，即一个酶分子的催化部位可磷酸化同一分子的其它部位。翻译水平的调节最近几年研究证明：自身磷酸化是蛋白激酶调节其活性的重要方式。例如，磷酸化酶激酶自身磷酸化后其基础活性增高；依赖cAMP的蛋白激酶(Ⅱ型)的自身磷酸化可以影响其调节亚基与cAMP的结合与解离；胰岛素受体具有蛋白激酶的功能，自身被磷酸化后其活性不再依赖胰岛素。虽然对于这些自身磷酸化所引起的蛋白激酶特性的变化的具体调节机制和生理功能在多数情况下还不很清楚，但无疑这一特性为蛋白激酶所参与众多的生理过程提供了一种特殊而有效的自我调节方式。翻译水平的调节蛋白质组研究简介基因组(Genome)：是指一个细胞或病毒所包含的全部基因。是基因组计划的工作对象。翻译水平的调节一、蛋白质组学的定义及研究内容

蛋白质组(Proteome)一词最早由澳大利亚学者Wilkins等于1994年提出，指的是由一个基因组geneome或一个细胞、组织表达的所有protein。蛋白质组学(proteomics)是研究在特定时间或环境下某个细胞或某种组织的基因组表达的全部蛋白质。翻译水平的调节蛋白质组学的真正含义在于:它不是按照传统的方式孤立地研究某种蛋白质分子的功能,而是应用各种蛋白质组学技术研究某种蛋白质在复杂的细胞环境中的功能。蛋白质组学旨在列出全部蛋白质的细目,弄清每一个蛋白质的结构和功能及蛋白质群体内的相互作用,对比在疾病和健康状态下它们的表达水平的变化。翻译水平的调节

与以往的经典蛋白质化学研究相比，蛋白质组的研究对象不再是单一或少数蛋白质，而是着眼于全面性和整体性，需要研究体系内所有蛋白质组分的物理、化学、生物学性质与功能，最终获得每个蛋白质组分的性质功能、表达变化及翻译后加工的大规模信息。翻译水平的调节蛋白质组与基因组的关系

蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获知。蛋白质构象病更难于只靠DNA序列来解释。翻译水平的调节ＤＮＡ序列所提供的信息仅仅是一种静止的资源，而细胞的生命活动是通过各种蛋白质来实现的一种动态过程。一个机体内所有不同的细胞都共享同一基因组，然而同一个机体的不同细胞和不同组织却有不同的蛋白质组，而且机体在不同发育阶段，直至最后消亡的全过程中蛋白质组也在不断变化。因而蛋白质组要比基因组复杂得多。

翻译水平的调节正如RajParekh所说的那样：“在一个细胞里，基因组能告诉我们理论上有哪些蛋白质会被表达，mRNA能告诉我们哪些蛋白质可能被表达，而蛋白质组却告诉我们蛋白质表达的时间、地点、种类和数量。”翻译水平的调节二、蛋白质组学的研究内容1.细胞或组织内蛋白质的表达模式及修饰（表达蛋白质组学）；2.蛋白质的序列和高级结构（结构蛋白质组学）；3.蛋白质的胞内分布及移位（细胞图谱蛋白质组学；4.蛋白质的功能模式（功能蛋白质组学）：蛋白质与蛋白质及其与其他分子的相互作用；翻译水平的调节

三、蛋白质组学研究的程序翻译水平的调节生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得翻译水平的调节

蛋白质组学研究的程序蛋白质组研究的核心──用于分离的双向电泳(2-DE)

翻译水平的调节+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10第一向：等电聚焦

翻译水平的调节+–pH3pH7.5pH10–pH3pH7.5pH10chargesize第二向：SDS电泳

Proteinsmigratethroughthegelatarateproportionaltotheirsize.Smallestproteinstravelthefurthestdistance翻译水平的调节翻译水平的调节MoreDatawithNarrowRangeIEFpH3-10pH3-6pH5-8pH7-10IPG EffectiveStrip pHOverlappingLength Range GelArea24cm 3-10 56cm18cm3-1044cm17cm 3-10 40cm11cm 3-10 26cm7cm 3-10 16cm翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点,随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(spot)翻译水平的调节蛋白质组技术的支柱——鉴定技术(Identication)翻译水平的调节翻译水平的调节蛋白质组技术的支柱——鉴定技术考马斯亮蓝染色和银染2.微量测序3.质谱技术翻译水平的调节适用于质谱的染色方法（公司产品）考马斯亮兰（Bio-Safe™Coomassie™colloidal250stain）

银染（SilverStainPlus™stain）荧光染色（SYPRO®Rubyproteingelstain）翻译水平的调节

StainingTrayOptimizingStainingEfficiency

ShakingRackSolutionBox

LidwithMotorIdealshakingmotionforoptimalstainingefficiency(patentpending)翻译水平的调节翻译水平的调节翻译水平的调节蛋白质组技术的支柱——鉴定技术2.微量测序3.质谱技术翻译水平的调节2D電泳→

Mass及序列分析翻译水平的调节蛋白质组研究的依靠——计算机及数据库数据库(database)

生物信息学翻译水平的调节蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。翻译水平的调节翻译水平的调节四、蛋白质组学研究的应用

翻译水平的调节

原核及简单真核生物的蛋白质组研究

流感嗜血杆菌的蛋白质组研究大肠杆菌的蛋白质组研究致病微生物的蛋白质组研究酿酒酵母的蛋白质组研究翻译水平的调节

流感嗜血杆菌的蛋白质组研究

流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)是第一个获得基因组全序列的生物.瑞士的一个小组通过2-DPAGE研究了流感嗜血杆菌的蛋白质组分,在ｐＨ3-10的范围内鉴定了约300个蛋白质组分,然后用有两个尿素浓度的麦黄酮(tricine)胶分离了很难分离到的5-20ku范围内的蛋白质,还鉴定了其中的80种.另外用肝素亲和层析将碱性蛋白质富集后,在ｐＨ6-11的范围内又鉴定了102个蛋白质,其中许多是核酸结合蛋白尤其是核糖体蛋白.华盛顿大学的另一个小组将双向电泳得到的流感嗜血杆菌303个蛋白质斑点进行质谱分析,确定了263个蛋白质,其中大部分是外膜蛋白,以及与能量代谢和大分子合成相关的蛋白质.另外发现了几种不能在基因组中找到对应序列的蛋白质.令人惊奇的是,大约22%的被鉴定了的蛋白质表现出与预计不同的等电点与分子质量,显示它们可能经过了翻译后加工。翻译水平的调节大肠杆菌的蛋白质组研究

大肠杆菌全部4000多个基因的ＤＮＡ序列已被测定,人们想到如果把双向电泳得到的蛋白质谱与基因组分析结果联合起来,就会得到更多有用的信息.基于此想法,建立蛋白质基因联合数据库,希望籍此来回答以下几方面的问题:ａ所有编码基因的产物在双向图谱上的位置,ｂ各种蛋白质的丰度,ｃ不同条件下各种蛋白质表达水平及合成速率的变化,ｄ各种蛋白质在细胞内的定位,ｅ某些蛋白质翻译后修饰的方式及水平.目前,大肠杆菌的联合数据库已更新到第六版,大约包括1600个蛋白质斑点的数据,其中大约400个蛋白质斑点已与大约350个基因相对应(有些基因可能有多个蛋白质产物),对于这些蛋白质,这个数据库可以提供基因名称、蛋白质名称、EC编号、功能范畴、Swiss-prot数据库编号、Ｇenbank序列号、基因图谱的位置、染色体上的转录方向以及一些生理信息(如在不同生长条件下该蛋白质在细胞内的丰度).

翻译水平的调节致病微生物的蛋白质组研究

蛋白质组的一个重要应用是在阐明新抗生素作用机理的研究上.当今,细菌对大多数抗生素都有了抗性,寻找作用于细菌内新的靶子的研究工作已经展开,找到了许多有效的抗菌化合物.但目前遇到的困难在于难以揭示新的化合物的作用靶子及其作用机理.有时虽在体外发现新化合物能够使某种蛋白质失活,但在体内是否有这种现象和这是否是抗菌的主要机制仍然未知,现在双向电泳分析提供了一个有效手段.例如在研究抑制核糖体类抗生素对细菌的作用机制时,对12种作用于翻译过程的不同阶段和核糖体内不同分子的抗生素加以考察,发现其中8种诱导冷休克反应的一系列蛋白质,另4种诱导一系列热休克反应的蛋白质,因此预计新的作用于核糖体的化合物也是诱导这两种反应,并且籍此可以推测大肠杆菌对冷热的反应发生于核糖体水平上.蛋白质组研究的重要优势在于能够从整体水平上分析不同条件下蛋白质谱的变化.例如作为一种差异显示技术,这一技术已被用于比较结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌蛋白的不同,结果发现一些在基因水平上很类似的蛋白在蛋白质水平上有很大差别,这可能部分解释近年来牛痘作为结核病疫苗会出现失败的现象。翻译水平的调节酿酒酵母的蛋白质组研究

利用双向电泳技术分析酵母蛋白谱的工作早