补肾通窍方对糖尿病大鼠丘脑前背侧核神经元bax与bcl-2表达的影响

补肾通窍方对糖尿病大鼠丘脑前背侧核神经元bax与bcl-2表达的影响

糖尿病的临床表现不仅具有“通常345”的典型症状外，还可能导致中枢神经系统的损伤。有研究表明糖尿病患者中有60%~70%存在获得性认知行为缺陷,表现为学习和记忆能力降低,其发生痴呆的风险为正常人的两倍,但以获得性认知行为缺陷为特征的糖尿病脑病的发病机制尚不清楚。国内外研究发现神经生长因子缺乏,神经细胞凋亡等因素,最终致使脑神经元受损、缺失,这可能是影响糖尿病脑神经功能的机制之一。海马是研究动物或人认知功能的经典脑区,既往研究报道大鼠认知功能受损与海马神经元的凋亡有密切关系;海马神经元凋亡可能是糖尿病大鼠学习与记忆障碍的机制之一。丘脑前侧背核(anterodorsalthalamicnucleus,ad)与行为、记忆存在一定关系,糖尿病是否会影响ad神经元的凋亡,目前尚未见相关报道。本实验以链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导糖尿病大鼠模型,通过SABC免疫组化染色,观察糖尿病大鼠与补肾通窍方治疗大鼠ad神经元Bax和Bcl-2的表达的差异,初步阐明糖尿病并发中枢神经系统神经元损伤的发病机制,以及该方对糖尿病神经元损伤的保护作用,并为进一步的临床治疗提供一定的实验数据。1材料和方法1.1实验动物的分组与使用清洁级SD成年雄性健康大鼠40只,体重,分为4组,每组10只,由浙江中医药大学动物实验中心提供,实验动物使用许可证:SYXK(浙)2008-0115。1.2抗bax自由基因子six链脲佐菌素(STZ):美国Sigma公司(S0130)。精蛋白锌重组人胰岛素注射液:LillyFranceS.A.S(S20020049)。一抗Bax:SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC(SC-526)。一抗Bcl-2(BA0412)、即用型SABC试剂盒(SA1022):武汉博士德生物工程有限公司。1.3中药饮片制备补肾通窍方(山药15g,黄芪30g,人参9g,川芎9g,熟地9g,石菖蒲5g,山茱萸9g,知母9g,丹参15g,葛根5g,五味子9g,天花粉9g,鸡内金9g,枸杞15g)中药饮片购自浙江省中医院,按含量为4g生药/mL煎成汤药,置于无菌容器后,于4℃保存备用。1.4实验方法1.4.1造模成功检测大鼠血糖40只大鼠随机分为4组:正常对照组、糖尿病模型组、补肾通窍方治疗组和胰岛素治疗组,每组各10只。适应性喂养1周后,禁食12h,除正常对照组外,其余三组大鼠按55mg·kg-1体重一次性腹腔注射STZ(用0.1mol·L-1PH4.4的柠檬酸缓冲液新鲜配成2%溶液),72h后做血糖检测,空腹血糖≥16.7mmol·L-1者为造模成功。正常对照组腹腔注射等量缓冲液。1.4.2组大鼠输注前后血糖控制方案补肾通窍方治疗组于造模前15d至成模后4周每天灌服补肾通窍方16g·kg-1;胰岛素治疗组在成模后,先以基础量2IU胰岛素皮下注射,再根据大鼠血糖进行调整,控制空腹血糖<10mmol·L-1,一直给药到灌注前;其余两组在成模后灌服与补肾通窍方治疗组相同剂量的生理盐水。1.4.4免疫组染色按照SABC法试剂盒操作要求进行,分别作Bax、Bcl-2免疫组化染色,常规脱水、透明、中性树脂封片。1.4.5脑切片观察参照包新民《大鼠脑立体定位图谱》,选鼠脑B-1.2至B-2.2平面,每只大鼠选取相同部位核团清晰的3张脑切片观察ad。放大400倍,用目镜网格显微测微尺计数0.01mm2内阳性神经元数,作为细胞密度。1.4.6统计分析各组间均数采用方差分析并进行两两比较,经SPSS13.0软件处理,所得数据以均数±标准差表示。2结果2.1中药治疗大鼠血糖指标实验期间,正常对照组大鼠活动正常,精神佳,毛有光泽,进食量、饮水量,尿量正常;糖尿病模型组大鼠精神萎靡,反应迟钝,喜静,皮毛蓬松无光泽,与其余三组相比,明显消瘦、血糖偏高,饮水量、饮食量、尿量明显增多。中药治疗组大鼠和胰岛素治疗组大鼠在初造模后精神萎钝,活动较少,“三多”症状明显,随治疗时间延长,大鼠精神恢复佳,毛色渐有光泽,活动逐渐增多,无明显行动迟缓,“三多”症状逐渐改善,但二组血糖波动均范围较大。各组大鼠体质量及血糖情况,见表1。2.2各组bax、bcl-2阳性细胞密度的比较丘脑前背侧核核团位于丘脑髓纹外侧,第三脑室下方。各组大鼠ad神经元均可见到Bax和Bcl-2免疫阳性细胞,两种免疫阳性细胞都呈棕黄色,胞质浓染,少数淡染,核不着色,细胞多呈圆形。糖尿病模型组Bax阳性细胞密度较正常对照组、补肾通窍方治疗组、胰岛素治疗组高(图1~8),而Bcl-2阳性细胞密度降低(图9~16);正常对照组Bax阳性细胞密度较补肾通窍方治疗组、胰岛素治疗组高,而Bcl-2阳性细胞密度无显著性差异;补肾通窍方治疗组和胰岛素治疗组的Bax、Bcl-2阳性细胞密度无显著差异。各组大鼠ad神经元Bax和Bcl-2阳性细胞密度及Bax/Bcl-2的比值,见表2。3糖尿病患者的通交流药及疗效中医学将糖尿病归属于“消渴”范畴,典型的临床表现为“多饮、多食、多尿、身体消瘦”的症状,病机主要是禀赋不足,阴津亏损,燥热偏胜。然本病症为本虚标实之症,又以虚实夹杂多见,其本虚在于阴虚,脏腑失于滋润,其标实在于燥热。在其病变过程中,五脏均可伤及,但主要同肺、胃、肾三脏关系密切,尤以肾最为重要,故中医治疗上以滋阴清热,益气补肾为总原则。中医古籍中虽未有糖尿病脑病的概念,但根据其临床表现,本病应隶属于消渴合并“呆病”、“健忘”的范畴,对此,在一些中医古籍中亦有所表述。如《圣济总录》中言“消渴日久,健忘征忡”,《兰室秘藏》中亦曰“上下齿皆麻,舌根强硬,肿痛,四肢痿弱……喜怒善忘”。糖尿病脑病病机核心是瘀阻脑络。著名老中医张发荣亦认为肾气亏虚于下,清窍瘀阻于此是该病的基本病机。故以此为依据,本实验自拟补肾通窍方治疗。该方由张景岳的在归饮和张锡钝的玉液汤二方加减而成。在归饮善补肝肾之阴,玉液汤能固肾补脾益气,具滋阴生津止渴之功,又佐以丹参、川芎养血活血,石菖蒲益智开窍化痰,观全方益气滋阴以治其本,活血开窍以治其标,标本兼顾,在临床治疗中取得了较好的疗效。丘脑前背侧核属于丘脑前核群,前核接受乳头丘脑束和穹窿纤维的终止,前核发纤维经内囊额部,投射至扣带回,扣带回各区也发纤维返回至前核,1937年Papez提出如下环路:认为它是感情行为的解剖基础,后有研究证明它与近期痕迹记忆有关,若损伤乳头丘脑束,病人失去近期记忆。刺激或切除乳头丘脑束还可改变内脏的交感反应,影响体内环境的调节。Bax为促凋亡蛋白,Bcl-2为抗凋亡蛋白。多项研究表明,Bcl-2表达占优势,细胞增殖大于凋亡,而Bax表达占优势表现为凋亡增加,从而影响机体功能。因此,可以推测Bax的高表达可促进细胞凋亡的发生,而Bcl-2可拮抗其作用。此外,亦有研究证实,Bax和Bcl-2调节细胞调整,与BaxBcl-2的比值亦有关系,当Bax/Bcl-2<1时,对细胞凋亡起抑制作用,细胞趋于存活;当BaxBcl-2>1时,对细胞凋亡起促进作用,细胞趋于死亡。本实验显示,糖尿病模型组大鼠精神萎靡不振,活动迟缓,丘脑前背侧核较正常对照组Bax阳性细胞密度增多,Bcl-2阳性细胞密度减少,Bax/Bcl-2>1;补肾通窍方治疗组和胰岛素治疗组大鼠精神佳,无明显的行动迟缓,Bax阳性细胞密度比糖尿病模型组减少,而Bcl-2阳性细胞密度增多,Bax/Bcl-2<1。说明补肾通窍方和胰岛素可以上调ad神经元Bcl-2的阳性表达,下调Bax的表达,抑制神经细胞的凋亡,保护脑神经元的功能,从而改善大鼠糖尿病的症状及认知功能,其具体的作用机制有待进一步研究。1.4.3灌注固定,固定造模成