妊娠高血压大鼠脑室旁核、视上核及孤束核的免疫荧光染色研究

妊娠高血压大鼠脑室旁核、视上核及孤束核的免疫荧光染色研究

妊娠高血压综合征（pih，妊娠高血压综合征）是妊娠高血压综合征的主要原因之一。目前，其病因和发病机制尚不清楚。随着人类基因组计划研究的深入,目前较多学者认为,妊高征有家族遗传倾向,是一种多基因遗传病。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)一直为妊高征病因学研究的重点。现已发现RAS中诸多的基因可能参与了妊高征的发生发展。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中最重要的成分,是已知内源性升压物质中作用最强的激素之一,AngⅡ受体是RAS的效应器,AngⅡ大部分生物学效应是通过AngⅡ1型受体(AT1)介导的,AT1是RAS作用的关键环节。PIH发病过程中周围脏器(血管、心脏、肾脏)的损伤是显而易见的,然而在中枢神经系统的变化,尤其是心血管中枢的改变却未见报道。本实验探讨在PIH病理生理过程中母体脑内的心血管调节核团孤束核(NTS)、下丘脑室旁核(PVN)、视上核(SON)内AT1含量的变化,为进一步研究中枢对心血管活动的调节机制,以及RAS在妊娠高血压的发病过程中的作用提供形态学依据。1材料和方法1.1模型分组与血压测量用亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)阻断一氧化氮(NO)合成可使孕鼠产生PIH特征及相应的病理生理改变,本研究采用此方法制备PIH动物模型。10周龄SD雌性大鼠12只(180±10)g,南京医科大学动物中心提供,在相同环境下用正常饲料喂养。按雌雄2∶1合笼,次日根据阴道涂片镜检,以发现精子作为妊娠第1天。受孕后随机分为2组,每组6只。(1)模型组:从孕13d至分娩每日皮下注射L-NAME250mg/kg;(2)对照组:正常妊娠组,从孕13d至分娩每日皮下注射生理盐水。血压测量:室温20℃,2组大鼠在清醒状态下,于每日上午9时用尾筒法测定尾动脉收缩压和舒张压,直至分娩。计算平均动脉压,取其平均值(舒张压+1/3脉压)。尿蛋白测定:分别于妊娠第12-20天用标准代谢笼收集孕鼠24h尿量,以考马斯亮蓝结合法测定尿蛋白浓度。仔鼠测量:剖宫取仔,记录胎鼠数,测胎鼠体重。1.2制作和切割于妊娠21d巴比妥钠麻醉下,常规灌注、取材将含PVN、SON、NTS的组织块在冰冻切片机中作连续冠状切片(厚30μm)。1.3igma和igg生长切片经5%BSA室温封闭20min后,加兔抗AT1IgG(1∶200,美国Sigma公司)37℃孵育2h,然后4℃孵育24h,PBS充分洗涤;加FITC标记山羊抗兔IgG(1∶100,南通碧云天公司)37℃孵育60min,PBS充分洗涤;甘油封片,荧光显微镜(德国Leica公司DFC300荧光显微镜)下观察并拍照。1.4细胞计数免疫荧光切片采用LeicaLAS图像分析系统(德国Leica公司)分析。1.5统计学处理:在共调解时,单位面积计算模型化后,显著性检验为1.实验数据均应用SPSS10.0软件进行统计学处理,统计结果用均数±标准差(x±s)表示,组间比较用t检验,显著性水平设为α=0.05。2结果2.1l-ng劳动pih组和正常组孕鼠尿蛋白水平比较PIH组平均动脉压为(135.0±4.5)mmHg,对照组平均动脉压为(99.5±3.0)mmHg。经t检验,P<0.05,可见PIH组血压明显高于正常对照组。皮下注射L-NAME后,给药组孕鼠尿蛋白浓度显著增加[(381.26±50.29)mg/Lvs(632.75±62.15)mg/L,P<0.05];胎鼠体重降低[(3.92±0.56)vs(3.25±0.41),P<0.05)]。2.2室旁核和亚核pvo参照Armstrong对大鼠PVN各亚核的划分标准,结合Paxinos和Watson大鼠脑立体图谱,将PVN分为4个大细胞亚核:前连合核(AC)、内侧室旁核(PVM)、外侧室旁核(PVL)和室旁核后亚核(PvPO)。荧光显微镜下可见,两组大鼠PVN内AT1免疫阳性神经元呈楔形集中分布于PVN的PVM和PVL,尤其在PIH组PVL尾侧部AT1细胞数量较多,密集分布在PVL的背外侧(图1)。至PvPO水平AT1细胞数量减少,细胞散在分布于PVL背外侧部。AT1免疫阳性神经元胞体发出绿色荧光,细胞表面有绿色的反应颗粒分布,胞体主要为圆形、卵圆形或梭形。PIH组阳性细胞数较对照组多(105.67±30.35vs78.46±27.03,P<0.01)。2.3大鼠son的表达SON细胞群密集分布于大脑底部视交叉(OC)上方的两侧。核团呈三角形,顶尖向内侧倾斜。镜下PIH组和对照组大鼠的SON可见AT1阳性细胞群。SON主部AT1阳性神经元分布较为密集,呈内侧稍宽的带状分布于OC的外上方(图2)。SON内的AT1免疫阳性神经元以大细胞型为主,神经元胞体大,两组大鼠SON内AT1阳性细胞数差异无统计学意义(79.13±20.30vs68.71±21.03,P>0.05)。2.4神经元的分布AT1阳性神经元在两组大鼠NTS内均有分布,而在PIH组呈现明显的亚核分布特异性。在最后区(AP)平面,阳性神经元主要位于NTS的背内侧、内侧和背外侧亚核;在闩平面,阳性神经元主要位于NTS的联合亚核;在NTS的腹外侧亚核也可见部分阳性神经元分布(图3)。AT1免疫阳性神经元表面有绿色的反应颗粒分布,胞体主要为圆形或卵圆形。PIH组NTS内阳性细胞数较对照组多(91.04±34.46vs64.29±31.36,P<0.01)。3妊娠高血压大鼠外周血at1的表达变化本实验应用Yallampalli等的制模方法,L-NAME抑制NO合成后,孕鼠血压明显升高,尿蛋白显著增加,胎鼠体重降低,胎鼠宫内发育迟缓等一系列变化,与人类妊高征的症状及病理生理变化相似,说明妊高征动物模型是成功的,与文献报道一致。胡玉红等研究表明在妊高征时1166A→C变异体(AC、CC)和C等位基因的频率明显高于正常妊娠,认为AT1基因A1166C多态性与妊高征有关。Wallukat等从妊高征患者血清中提取的免疫球蛋白可激活AT1,加快新生鼠心肌细胞的跳动,分娩后这种作用逐渐减弱,而正常妊娠妇女则无此作用,并证实这种免疫球蛋白为IgG,其作用于AT1的第2个细胞外环,由PKC介导。认为妊高征患者体内存在AT1的兴奋性自身抗体。这些研究都表明在妊娠高血压的病理过程中,患者外周AT1表达是异常的。在中枢,有文献报道正常大鼠下丘脑PVN、NTS和终板是AT1分布最密集的区域,内源性的AngⅡ可能主要在NTS释放,脑内AngⅡ的作用主要由AT1介导的。对妊娠高血压状态下,脑内AT1的分布尚缺乏报道。作者在对PIH大鼠的脑内心血管核团PVN、SON和NTS的研究中发现:PIH大鼠与对照组大鼠一样,在PVN、SON和NTS都有AT1阳性细胞;在PVN和NTS,PIH大鼠阳性细胞数较对照组多。提示中枢AT1的异常增加可能与妊娠高血压的发病有关。NTS是最基本的血管中枢和心血管传入神经中继站,接受由颈动脉窦、主动脉弓和心脏感受器经舌咽神经和迷走神经传入的信息,然后发出纤维至延髓和中枢神经系统其他部位如蓝斑和下丘脑的神经元。结合本实验结果可作如下推测:由于心血管的传入信息