登革病毒非结构蛋白ns3npaserna解旋酶结构域的表达及活性研究

登革病毒非结构蛋白ns3npaserna解旋酶结构域的表达及活性研究

近年来，登甲病毒（den）的流行形势更加严峻。据报道，世界上大约25亿人口受到了登甲病毒感染的威胁。目前尚无特异有效的疫苗和抗病毒制剂。登革病毒非结构蛋白NS3是一种多功能蛋白,N端具有Ser蛋白酶活性,C端具RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性,参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5′端加帽。NS3具有良好的免疫原性,存在多个登革病毒特异性CD4+、CD8+T细胞表位,且多具型间交叉免疫特性。登革病毒非结构蛋白NS3已成为有吸引力的抗病毒靶标。本研究目的在于构建DENNS3表达体系,获得DENNS3表达产物,并对其活性作初步研究,为抗DEN制剂的筛选打下实验基础。重组质粒的构建病毒、细胞、菌株和质粒:登革2型病毒D2-43株引自本所病毒室;BHK-21细胞株本室保存;大肠杆菌BL21(DE3)本室保存;原核表达载体pET28a为Invitrogen公司产品;登革病毒NS5的原核表达载体pQE30-NS5本室构建并保存。试剂:Trizol试剂GIBCO公司产品;金属螯和亲和层析柱(Ni-NTAagrose)购自德国QIAGEN公司;SuperScriptTMⅡ逆转录酶Invitrogen公司产品;高保真PyrobestDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶均为TaKaRa公司产品;质粒DNA纯化试剂盒及DNA凝胶回收试剂盒分别为Sigma和塞百盛公司产品,BCA蛋白浓度试剂盒为天象邦定公司产品。登革2型病毒小鼠免疫腹水抗体为本所病毒室惠赠;poly(A)为Sigma公司产品,其他试剂为国产分析纯。引物:根据病毒株序列以DNAStar软件设计引物,交上海生工生物有限公司合成,其序列为:F5002:5′-(NcoⅠ酶切位点)GAACTCCATGGCATATGTGAGTGCTATAGCCCAGACT-3′,R6375:5′-(HindⅢ酶切位点)CCGCAAGCTTCTTTCTTCCAGCTGCAAACTCCT-3′。表达载体的构建RT-PCR扩增登革2型病毒NS3NTPase/RNA解旋酶结构域编码基因:以Trizol试剂提取的感染登革2型病毒的BHK-21细胞总RNA为模板,以DEN-2NS3蛋白编码基因3′端引物R6375为反向引物进行反转录反应,RT-PCR扩增目的基因。循环参数为:94℃5min后,94℃30s,48℃30s,72℃90s,30个循环,72℃延伸5min。重组表达载体的构建及鉴定:PCR扩增产物经NcoⅠ、HindⅢ双酶切后,连入表达载体pET28a,CaCl2法转化宿主菌BL21(DE3)。筛选获得的重组质粒命名为pET28a-dNS3。分别用PCR和酶切分析对插入的dNS3片段进行鉴定,并送上海生工生物有限公司测序。目的蛋白的诱导表达和纯化:自培养板上挑取BL21(DE3)/pET28a-dNS3单菌落,转入5ml含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中,37℃摇菌过夜。转入500ml含卡那霉素的高浓度肉汤培养基中,于37℃剧烈摇菌至A600为0.6,加入IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续25℃培养6h。离心集菌,以10ml裂解缓冲液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑)悬浮,加入溶菌酶至1mg/ml,加入苯甲磺酰氟(PMSF)至1mmol/L,超声破碎。将裂解液上清与2mlNi-NTA树脂混合,冰浴振荡1h后倒入空柱中,待裂解液流出后以20ml洗液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑)洗柱体,以10ml洗脱液(20mmol/LTris-HCl,300mmol/LNaCl,100mmol/L咪唑)洗脱表达产物,收集洗脱液。用Centricon-YM50超滤柱(Millipore)将洗脱液浓缩至0.5ml。BCA法测定蛋白浓度。表达产物的Westernblot分析:SDS结束后,将胶上蛋白转移至硝酸纤维素膜上,用3%牛血清白蛋白的TBST室温封闭5h。TBST洗涤3次,每次5min,加入封闭液稀释的小鼠抗D2-43腹水抗体(1∶100),室温孵育2h。TBST洗涤10min×3,加入封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶500),室温反应2h。TBST洗涤3次,再以TBS洗涤2次。将膜置于新鲜制备的5ml生色液(含DAB3mg,30%H2O210μl,0.3%NiCl20.5μl)至出现清晰条带。纯化产物的NTPase活性检测:根据Henkel等人的方法,测量NTP水解释放磷酸根(Pi)的数量以检测活性。终止液测量前配置,组分为孔雀绿(质量浓度为0.0812%)、聚乙烯醇(质量浓度为2.32%,沸水配制)、钼酸铵(质量浓度为5.72%,溶于6mol/LHCl)、蒸馏水,以2∶1∶1∶2混合,室温2h内使用。反应体系(50μl)包括酶纯化产物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、ATP、MgCl2等,室温反应20min,加终止液室温作用5min后加25μl30%柠檬酸钠室温作用5min,酶标仪测量630nmA值。酶量对dNS3ATPase活性的影响:反应体系(50μl)包括酶纯化产物、Tris-HCl(20mmol/L、pH7.0),2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室温反应20min。酶纯化产物加入量分别为5、10、20、40、80、160、240、320、400ng。时间对dNS3ATPase活性的影响:反应体系(50μl)包括80ng酶纯化产物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、0.5mmol/LATP、2mmol/LMgCl2。反应时间分别为5、10、20、30、40、50min。dNS3对不同NTP底物NTPase活性比较:反应体系(50μl)包括80ng酶纯化产物、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、0.5mmol/LNTP、2mmol/LMgCl2,室温反应20min。酶反应底物分别为ATP、CTP、GTP、UTP。NS5对dNS3ATPase活性的促进作用:NS5的表达纯化参见文献。NS5纯化产物经透析脱盐,超滤浓缩,BCA法测定蛋白浓度。该反应体系(50μl)包括dNS3纯化酶产物1μg、NS5纯化酶产物0.5μg、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室温反应20min。Poly(A)对dNS3ATPase活性的促进作用:反应体系(50μl)包括纯化酶产物1μg、2μgpoly(A)、Tris-HCl(20mmol/L,pH7.0)、2mmol/LATP、2mmol/LMgCl2,室温反应20min。结果1.重组原核基因表达质粒及酶切鉴定PCR扩增产物经HindⅢ、NcoⅠ双酶切后,连入表达载体pET28a,转化大肠杆菌,在含卡那霉素的平板上选择阳性克隆,PCR及HindⅢ、NcoⅠ酶切分析鉴定阳性克隆,获得相应大小的目的基因片段。重组原核表达质粒命名为pET28a-dNS3。图1为NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域(160～618AA)基因和表达质粒pET28a-NS3的酶切鉴定电泳图。将阳性克隆送上海生工生物有限公司测序,测序表明所克隆蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域基因与GenBank中登革2型病毒D2-43株序列一致,未出现错义突变,酶切结果显示插入正确。2.pet28a-ds3蛋白的表达携带有重组表达质粒pET28a-dNS3的工程菌经IPTG诱导后表达一个相对分子质量(Mr)约为54×103的特异蛋白,大小与预期一致,且对照菌无此蛋白出现。图2为pET28a-dNS3在诱导条件下与对照的全菌裂解液12%SDS分析。细菌裂解液上清与Ni-NTA树脂混合后经漂洗、洗脱,分步收集洗脱液,得到纯度较高的dNS3蛋白。图3为纯化产物的SDS。3.免疫蛋白参与了de2c病毒的免疫反应Westernblot(图4)表明,表达的dNS3蛋白能够与DEN2病毒免疫血清产生特异的抗原抗体反应,而对照菌裂解液反应阴性。说明重组蛋白dNS3具有良好的抗原性,经电泳变性后仍可与相应抗体发生特异性反应。4.ds3蛋白的表达纯化及其活性图5为加终止液后dNS3ATPase活性反应结果图,可见加有dNS3的反应孔与对照孔相比,呈明显的阳性结果,表明表达纯化所得的dNS3蛋白具有良好的ATPase活性。(1)ds3蛋白和atpase活性的关系ATPase活性的影响:图6为酶量对dNS3ATPase活性的影响结果,可见dNS3蛋白含量与其ATPase活性呈现大致的剂量关系,在dNS3蛋白含量为80ng时,对于实验结果的测量较为合适。(2)应时间对ds3ntpase活性的影响ATPase活性的影响:图7为反应时间对dNS3NTPase活性的影响结果,在反应时间为20min时,对于实验结果的测量较为合适。(3)dens3活性对三磷酸呤核苷酸atp,gtp的影响图8为dNS3对不同NTP底物NTPase活性比较结果,表明DEN2NS3的NTPase活性对三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更强的底物亲嗜性,其中ATP>GTP>UTP>CTP。(4)de2c非结构蛋白ns3和ns5对ase活性的影响ATPase活性的促进作用:图9为NS5、poly(A)对dNS3ATPase活性的促进作用柱形图,实验结果表明NS5的加入能促进dNS3ATPase活性,使其活性提高50%左右,此外,poly(A)对dNS3ATPase活性亦具促进作用,可使dNS3ATPase活性提高2～3倍。登革病毒的复制和多聚蛋白的加工是相耦联的过程,直接作用于病毒复制过程的非结构蛋白NS3已成为抗病毒药物研究的重要靶标。本研究在扩增出NS3基因的基础上,实现了NS3蛋白NTPase/RNA解旋酶结构域的克隆及可溶性表达,并对其活性进行初步研究。本研究表明DEN2NS3的NTPase活性对三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更强的底物亲嗜性,其中ATP>GTP>UTP>CTP,这与现有的其他型别登革病毒的NTPase活性的有关报道是一致的。双链RNA的解旋需要ATP水解释放能量;RNA解旋酶通常拥有促进ATP或NTP水解的内在活性,在RNA存在时水解NTP以提供RNA解旋所需能量。NS3与NS5(RNA依赖的RNA聚合酶)是登革病毒复制过程中两个重要的蛋白,功能上具协同性,本室已构建NS5的原核表达载体并实现了NS5的可溶性表达。蛋白质分子间相互作用多为氢键及离子键,故离子强度对其相互作用影响较大,当反应液中的离子浓度达到100mmol/L时,即观察不到NS5对dNS3ATPase活性的促进作用(结果未显示)。通过纯化产物透析脱盐,超滤浓缩,降低酶贮存液中的离子浓度,反应体系中离子浓度减至最小,在体外条件下证实了DEN2非结构蛋白NS5对dNS3ATPase活性的促进作用。提示在病毒复制时,NS3与NS5间的相互作用可能对NS3的ATPase活性有调控作用,两蛋白间的相互作用可能引起NS3活性位点的构象变化,加强了与底物间的亲和力,从而促进了ATP的水解。本研究支持了Cui等人对DEN1型病毒NS5蛋白促进NS3蛋白NTPase活性的见解,也为体外筛选能影响NS3与NS5相互作用的活性物质提供了一个可选的高通量的筛选模型。Cui等人研究表明DEN1NS3的NTPase活性对三磷酸嘌呤核苷酸(ATP,GTP)有更强的底物亲嗜性,但poly(U)及poly(A)的添加并没有促进其活性。而Li等人的研究表明poly(A)和poly(U)能极大地促进DEN2病毒NS3的ATPase活性。本研究证实了poly(A)对DEN2病毒dNS3ATPase活性所具有的促进作用,可使dNS3ATPase活性提高2～3倍。Poly(A)对dNS3ATPase活性的促进作用,验证了dNS3对寡聚核苷酸的结合能力;同时也提示了DEN1型病毒NS3蛋白NTPase活性与DE