胫骨内接种mrm-1细胞制作乳腺癌骨转移大鼠模型的研究

胫骨内接种mrm-1细胞制作乳腺癌骨转移大鼠模型的研究

乳腺癌的骨转移可能导致高血钙、疼痛和病理性骨折，严重影响患者的生活质量，并引起临床和基础研究人员的注意。在基础研究中建立接近自然发病过程的动物模型十分重要,目前乳腺癌骨转移的造模方法大致有四类,包括自发性、化学诱导性、转基因诱导性和移植性乳腺癌骨转移动物模型,其中以移植性模型应用最为普遍。目前国内的移植性骨转移模型多采用裸鼠,但裸鼠体积较小,造模时操作困难,且存在价格较贵、饲养条件要求较高、取材少等不足。谭煌英博士在国内最先成功引进了乳腺癌骨转移大鼠模型。大鼠模型在形体、取材量、费用等方面存在明显优势。本研究小组对乳腺癌骨转移进程中的多个重要环节进行了研究,探讨了这一模型的特点,介绍如下:1材料表面1.1动物雌性SD大鼠,SPF级,体重150～160g,合格证号SCXK(京)2007-0001,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。1.2细胞MRMT-1转移性大鼠乳腺癌细胞株由日本东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心引进。1.3抗体和pcr引物抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒由美国SigmaAldrich公司生产;抗PCNA抗体由美国CellSignalingTechnology公司生产;抗OPG抗体和抗RANKL抗体由美国SantaCruzBiotechnology公司生产。dNTP、AMV反转录酶、重组RNA酶抑制剂和随机引物均由美国Promega公司生产;PCR引物由上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成;SYBRPremixExTaq由宝生物(大连)工程有限公司生产。1.4医用x光诊断系统21G/22G注射器针头由美国BectonDickinson(BD)公司生产。VonFrey纤维由美国NorthCoastMedical公司生产;大鼠失能测量仪由意大利2Biological公司生产。KXO-32R医用X光诊断系统由日本Toshiba公司生产;Prodigy双能X线骨密度仪由美国GeneralElectric(GE)公司生产。IX71型倒置显微镜和DP70数码成像系统由日本Olympus公司生产。SIGMA3-18K低温离心机由德国Sartorius公司生产;ND-1000紫外分光光度计由美国Nanodrop公司生产;AlphaImager2200凝胶成像系统由美国AlphaInnotech公司生产;PTC基因扩增仪由美国MJRearch公司生产;ABI7300荧光实时定量PCR仪由美国AppliedBiosystems公司生产。2方法2.1传代培养造模前1周对液氮中冻存的MRMT-1细胞进行复苏和传代培养。造模当天对培养瓶中贴壁生长的细胞进行胰酶消化,收集细胞悬液,洗涤计数后配制成浓度为1×106个/ml的细胞悬液,造模前置于冰上备用。2.2细胞输注模型组雌性SD大鼠分2批饲养,每批适应1周后按照体重分层,随机分为假手术组和模型组,每组共16只。造模步骤:将大鼠腹部向上置于鼠板上,左后肢皮毛用生理盐水湿润后剪毛,然后使用75%医用酒精消毒。取手术刀片切开胫骨上部的皮肤和肌肉,切口长度约1cm,暴露左胫骨内侧面。在膝关节以下约5mm处的胫骨内侧面,先用21G或22G针头穿刺打孔,针头穿透骨皮质进入骨髓腔后,使用微量注射器吸取生理盐水(假手术组)或配制好的癌细胞悬液3μl(模型组,细胞数约为3×103),缓慢注射入大鼠骨髓腔内。撤出微量注射器后迅速用骨蜡(在50～52℃水浴中保温)密封针孔以防癌细胞悬液从骨髓腔溢出。缝合肌肉和皮肤。造模当天记为第0天。2.3体重测量在造模前1天用电子天平称量体重,实验过程中每周称重1次并记录。2.4机械痛觉超敏试验在造模后第19天进行疼痛测定。通过50%缩足阈值(50%PWT)显示机械痛觉超敏,通过大鼠失能测量仪测定的双侧后肢负重差异表示机械痛觉过敏。热缩足反射潜伏期(TWL)用于评价热痛觉过敏。2.4.1左下肢眼底中心部位pwt的计算将大鼠置于金属网上,使用有机玻璃罩限制其活动,待梳理探究活动基本消失后,用标准化的VonFrey纤维刺激左后肢足底中心部位,采用up-down法计算50%PWT。2.4.2双术后负重量对比将大鼠放置在大鼠失能测量仪特制的有机玻璃小室内,前肢趴在斜面上,双后肢分别踩着2个相互独立的传感器,让动物适应1～2分钟后开始测量,测量时间为5秒,完毕后仪器即可显示出双后肢负重值。每只动物连续测3次,取算术平均值,对比双侧后肢负重量并计算差值:两侧后肢负重差值=右侧负重量-左侧负重量2.4.3TWL在热痛刺激仪的灯座上架放厚度为3mm的玻片,将大鼠置于玻片上,调整射灯使其聚焦在大鼠左后肢足底,记录从照射开始至大鼠出现缩足的时间,如果照射10秒大鼠仍未缩足则自动断开以免灼伤。每只大鼠测3次,间隔2分钟以上,最后取算术平均值。2.5术后大鼠肿瘤长度和短径观察造模后第21天进行取材,取材前已禁食10小时。使用0.45%戊巴比妥钠溶液按照1ml/100g体重腹腔注射,将大鼠麻醉。称量体重后处死大鼠,剪下左后肢。对于第1批饲养的大鼠,将剪下的左后肢直接置于4%多聚甲醛中进行固定,待X线检查后剥离皮肤和肌肉,用游标卡尺测定肿瘤长径和短径。按下列公式计算肿瘤体积:肿瘤体积=(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2对于第2批饲养的大鼠,剪下左后肢后立即将皮肤和肌肉组织剥离,暴露出带有转移肿瘤的胫骨,迅速测量肿瘤长、短径,使用经过RNA酶处理的手术剪剪下小块骨转移瘤组织置于液氮中冻存。2.6骨皮质结构正常对多聚甲醛固定后的大鼠后肢进行X线摄片(电压50kV,曝光时间2ms),对骨质破坏程度评分,标准如下:0分:骨结构正常,无任何骨质破坏的征象。1分:胫骨注射部位附近可见小型骨质缺损病灶(数量少于3个)。2分:髓质骨缺损,病灶增多(数量大于3个)。3分:髓质骨缺失,同时皮质骨受侵。4分:单面的骨皮质完全缺损。5分:双面的骨皮质缺失,移位性骨折。注:左侧为假手术组,骨皮质完整;右侧为模型组,本例骨皮质侵蚀严重2.7软骨和骨转移肿瘤在X线检查后将固定的大鼠后肢剥去皮肤和肌肉组织,保留完整的胫骨和骨转移肿瘤。将待测标本置于一个盛满水的塑料盒中,放在Prodigy双能X线骨密度仪的平台上扫描,计算骨矿物质含量(BMC)和骨密度(BMD)。2.8脱钙液的更换大鼠胫骨在4%多聚甲醛中固定约10天,然后转入脱钙液(10%甲醛+EDTA超饱和溶液)脱钙8周,每1～2周更换脱钙液1次。脱钙完成后进行石蜡包埋切片,完成的标本厚度约4μm。2.8.1he染色2.8.2trap细胞计数按照说明书进行TRAP染色,在IX71显微镜下观察,每张切片在高倍镜下(×400)随机选取5个视野,用DP70数码成像系统进行图像采集,然后对这些视野中的TRAP(+)细胞进行计数,取算术平均值。2.8.3观察形态观察按照说明书对PCNA、OPG和RANKL进行免疫组化染色。在IX71学显微镜下观察形态,每张切片在高倍镜下(×200)随机选取3个视野进行拍摄;使用Image-ProPlus(IPP)软件测定所拍摄的图像中被染成黄褐色部分的整体光密度(IOD)值,取算术平均值。2.9rp的mr-na含量从第2批大鼠含肿瘤的胫骨组织中提取总RNA,反转录cDNA,用荧光实时定量RT-PCR方法测定甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)的mRNA含量,并以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的mR-NA含量作为内参照。引物序列如下(表1):在ABI7300荧光实时定量PCR仪中进行反应,记录Ct值,通过比较Ct值方法对两组样品所含的PTHrPmRNA进行相对定量,公式如下:目的基因的相对量=2-ΔΔCt其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。2.10术后负重量比较数据录入Excel软件进行保存,使用SPSS15.0软件分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析进行组间比较。同一组内的大鼠两侧后肢负重量比较采用配对t检验进行比较。50%PWT和影像学评分为等级资料;TRAP细胞计数为频数资料,以上3组数据用秩和检验进行分析。3结果3.1体重测两组大鼠造模前体重无差异,显示基线水平一致,在饲养过程中两组大鼠体重均逐渐增长,但组间比较仍无差异。3.2疼痛测试3.2.1机械痛觉超敏状态模型组50%PWT较假手术组明显降低(P<0.01),这提示存在机械痛觉超敏状态。假手术组双侧后肢负重则较为平衡,模型组出现双侧下肢负重不平衡的情况(P<0.01);模型组双侧后肢负重差值明显高于假手术组(P<0.01),提示存在机械痛觉过敏。3.2.2热痛的代价模型组大鼠左足受到热辐射后的TWL较假手术组明显缩短(P<0.01),提示存在热痛觉过敏的状态。3.3肿瘤体积假手术组无肿瘤生长,因此模型组与之比较差异明显(P<0.01)。3.4注射部位皮质缺损通过X线检查发现,假手术组大鼠仅有1只在左胫骨注射部位出现轻度骨质缺损,考虑为手术本身造成的损伤未完全愈合,其余大鼠均呈现正常的骨结构,无骨质破坏征象,模型组骨质受损严重(P<0.01)。3.5bmc和bmc两组间BMC无统计学差异,模型组BMD较假手术组降低(P<0.05)。3.6骨小梁排列网HE染色可以显示出两组大鼠胫骨组织的形态变化。在低倍镜(×40)下可见:假手术组大鼠胫骨结构完整,骨皮质连续,骨小梁排列规则,骨髓腔内充满深染的血细胞。模型组骨髓腔内外均可见大量肿瘤细胞浸润,形态不规则,排列紊乱。部分骨皮质被肿瘤组织所取代,连续性中断,呈现火山口样结构,甚至形成肿瘤组织包围的孤岛状。骨皮质与周边不成熟的编织骨和软骨相移行,新生骨组织间隙内可见肿瘤细胞,编织骨表面整齐排列一层成骨细胞。3.7模型组和假手术组trap+细胞的表达情况破骨细胞在TRAP染色下胞浆红染,即TRAP(+)。假手术组仅在骨基质边缘见到少量TRAP(+)细胞,通常是单个出现。模型组在被侵蚀的骨基质边缘和瘤体中均可见到成群甚至大群分布的TRAP(+)细胞,大小不一,其中可见多个巨型多核细胞,体积明显大于假手术组。通过计数,模型组TRAP(+)细胞均明显多于假手术组(P<0.01)。说明模型组出现了破骨细胞过度激活的情况,这是溶骨性骨质破坏的核心环节。3.8组pcna和rakenl的比较光镜下免疫组化染色(+)部分呈现黄褐色,使用IPP软件测量IOD值进行半定量分析,模型组PCNA和RANKL有升高趋势,但无统计差异。模型组较假手术组的OPC水平和OPG/RANKL比值下降(P<0.05或P<0.01)。说明在本模型中肿瘤细胞并没明显增加RANKL的表达,但会抑制OPG的表达,从而降低OPG/RANKL比值,造成破骨细胞的过度激活。3.9ptrtp的高表达通过比较Ct值的相对定量方法对两组样品所含的目的基因PTHrP的mRNA进行相对定量,模型组低于假手术组(P<0.01),这一结果说明此模型不具有PTHrP高表达的特征。4乳腺癌骨转移中pthp的表达本研究使用的乳腺癌骨转移大鼠模型是将MRMT-1大鼠乳腺癌细胞接种至SD大鼠胫骨骨髓腔内建成,随着肿瘤生长,骨质逐渐受损,同时伴有癌性骨痛表现。模刨组大鼠在术后第19天已出现机械痛觉超敏、机械痛觉过敏和热痛觉过敏,第21天取材后胫骨X线影像显示明显的骨质破坏、BMD下降,形态学观察可见肿瘤在骨髓腔内和胫骨周边呈浸润性生长,侵蚀破坏骨皮质,同时伴有不成熟的编织骨和软骨形成。证实大鼠乳腺癌骨转移/癌性骨痛模型已成功建立。有研究显示,乳腺癌骨转移患者中以溶骨性病变为主要表现者占80%～85%。因此,本模型表现出的溶骨性改变是乳腺癌骨转移的重要特征,其核心环节是骨微环境中各种因素引起的破骨细胞过度激活,导致骨吸收作用失控。破骨细胞起源于单核-巨噬细胞系统,通常由多个单核细胞融合并激活才能具有活性,1个活化的破骨细胞可以溶解100个成骨细胞所形成的骨质。本项研究通过对破骨细胞的特征性酶TRAP进行染色比较两组大鼠破骨细胞的数量和活跃程度,模型组破骨细胞数量和活性均明显超过假手术组(P<0.01),这说明存在破骨细胞的过度激活,这与影像检查发现的骨质破坏一致,说明破骨细胞的过度激活所导致的骨吸收作用亢进是造成溶骨性病变的直接原因。OPG-RANKL-RANK系统是破骨细胞活化过程中的一个重要信号传导通路,此三者均为肿瘤坏死因子家族成员,RANKL是一种激动因子,可通过与破骨前体细胞表面的NF-KB受体激活因子(receptoractivatorofNF-KB,RANK)结合使之激活从而刺激破骨细胞分化成熟;OPG是RANKL的圈套受体,与RANK竞争RANKL,从而抑制破骨细胞的分化和成熟。RANKL和OPG的水平反映了骨吸收的程度,RANKL过多将增加骨吸收;OPG过多则抑制骨吸收,正常情况下二者处于动态平衡状态。发生肿瘤骨转移时肿瘤细胞释放的多种因子破坏了这种平衡,导致破骨细胞过度激活进而促进了骨吸收作用。同时,骨吸收时从骨基质中释放的TGF-β3等因子又会进一步促进肿瘤细胞增殖,从而形成“恶性循环”。有研究认为乳腺癌细胞可以分泌PTHrP,刺激成骨细胞和基质细胞表达RANKL,从而增强破骨细胞介导的骨吸收作用。本项研究中,PTHrP水平不但未升高反而出现下降,其机制有待更加深入的研究。动物模型是探索乳腺癌骨转移病理机制