登革病毒敏感性不同的几株细胞和生长发育细胞的体外培养

登革病毒敏感性不同的几株细胞和生长发育细胞的体外培养

病毒和细菌不同。病毒缺乏独立的酶和代谢系统，因此需要依靠生命主体细胞的酶和代谢系统来获得营养和繁殖。自从Harrison(1907)将组织细胞在体外人工培养成功后,病毒学家经过十几年的探讨,终于证明病毒能在体外的细胞上繁殖,从而建立了病毒的组织培养技术。登革热主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,该病广泛流行于热带及亚热带地区,是一种对人类危害较大的虫媒病毒性疾病,严重威胁着全球近半数人口的身体健康。登革热病毒因毒力滴度低,在细胞上的病变周期长,故对组织培养的敏感宿主细胞要求较严。本文对白纹伊蚊C6/36细胞、Ap-61细胞、LLC-MK2细胞、Vero细胞和BHK-21/13细胞的体外培养技术以及这些细胞对登革热病毒的敏感性问题进行了探讨。1材料和方法1.1准备细胞培训设备1.1.1瓶装瓶盐酸中浸泡过夜除去游离碱,在洗液中浸泡一天,经自来水彻底冲洗干净,再用蒸馏水和去离子水各洗三遍,晾干、包装、120℃干烤灭菌后备用。1.1.2制备成汁、灭菌先用1%盐酸煮沸30min,自来水冲洗后,用1%氢氧化钠煮沸30min,自来水冲洗,再用蒸馏水和去离子水先后煮沸15min,倾去热水晾干,用前高压灭菌。1.1.3pe塑料板96孔、48孔及24孔细胞培养板为Costar产品。1.2主要溶液的制备1.2.1两种母液的配制溶液1:NaCl80g,KCl4g,CaCl21.4g,MgSO4·7H2O2g;溶液2:Na2HPO4·12H2O1.52g,KH2PO40.6g,葡萄糖10g,1%酚红液16g。配制方法:①溶液1、2分别溶于稍少于500ml水(双蒸水或去离子水,下同)。②将溶液2缓慢加入溶液1中,边加边搅拌。③补足水至总体积1000ml即得10倍浓度的Hank母液。加入氯仿2ml作为防腐剂,储存于4℃备用。④母液1ml加水9ml,分装适量,用10磅高压蒸汽灭菌10~15min,置于室温备用,临用前NaHCO3液调整pH。1.2.2ph值的溶解目前有市售小包装。用去离子水(或双蒸水)1000m1溶解,在CO2通气下使pH达到6.0以下,待溶液清晰(表明完全溶解)为止。加入NaHCO3使pH到7.0,然后过滤除菌,分装后放置4℃保存备用。1.2.3血清牛血清一般试验室常用胎牛血清或小牛血清,冰冻保存,使用前在56℃水浴中灭活30min,并对各种细胞进行培养试验。1.2.47.5%碳酸氢钠溶液取7.5gNaHCO3(CP或AR)溶于100ml水中,用无菌玻璃滤器(G6)过滤除菌,分装小量,加橡皮塞封紧,4℃存放。1.2.5不同浓度的激素、链霉素减量和稀溶液的配制即青、链霉素液(简称双抗液),取5·218·河南医学研究第11卷瓶青霉素(4.0×106u/瓶)及两瓶链霉素(1g/瓶)分别溶于100ml无菌水溶液中混合,分装小量,冻存于-20℃,临用时按1%的比例加入营养液中(最后浓度为青霉素100u/ml,链霉素100μg/ml)。1.2.6除残细粒的制备将2.5g胰蛋白酶加入1000mlHank液或无Ca2+、无Mg2+离子的PBS液中,置于37℃水浴经常摇动使完全溶解;用细滤纸滤除残存细粒;用无菌玻璃器(G6)过滤除菌,分装小量,冻存于-20℃,临用前稀释至所需浓度,并用NaHCO3液调整至pH7.6。1.2.7po412h2oNaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO4·12H2O2.89g,KH2PO40.2g。加水至1000ml,完全溶解后,经15磅高压蒸汽灭菌15min,置于室温备用。1.2.8eagermem的配制这是一种按细胞生长最低要求用已知化学物质配制成的营养液,又称最低要素营养液(MEM)。它含有13种氨基酸、9种维生素和多种无机盐。EagleMEM可以自己配制,但比较麻烦,一般都采用市售的粉剂商品。使用时仅需将粉末加双蒸馏水配成1%溶液即可。灭菌方法则不同商品有不同要求,可按说明操作。有些必须用过滤除菌,有些可用高压蒸汽灭菌,但临用前需另加不耐热的经过滤除菌的谷氨酰胺溶液。1.3细胞培养1.3.1/5eager培养基白纹伊蚊(Aedesalbopictus)C6/36细胞株,生长液为RPMI-1640培养基加10%小牛血清,该细胞可分别适应在1/5PRMI-1640和4/5Eagle培养基或者单纯Eag1e培养基中生长。①选取长成单层的细胞,吸去旧的生长液。②加入新鲜配制的生长液3~5ml(生长液为Eagle加10%灭活的小牛血清,加青、链霉素各100u/ml和100μg/ml,调pH7.0),用5或10ml的吸管吹打10次左右制成细胞悬液。③一瓶细胞可传2~4瓶,小方瓶每瓶加细胞悬液5ml,大方瓶每瓶加入10ml。④摇匀后放置28℃孵箱中培养。⑤培养2~3d换液一次,一般3~5d长成单层。⑥长成单层后均可传代。1.3.2c6/36细胞株从伪盾伊蚊(Aedespseudosculellaris)中获得的另一种蚊虫细胞株,它的传代方法基本同C6/36细胞;仅培养液不同。生长液为含有10%灭活小牛血清和10%蛋白磷酸盐肉汤的L-15培养基,青链霉素常量;维持液将小牛血清的量减至2%,其他同生长液。1.3.3小鼠血清中hack免疫因子的检测LLC-MK2细胞为恒河猴肾传代细胞。①选取单层致密,细胞界限清楚,透明度好的培养细胞。②用Hack液洗1次,加0.2%胰酶在37℃孵箱消化1~2min。③加入生长液(Eagle65ml+HL25ml+10ml小牛血清,常量青链霉素,pH7.0),吹打制成细胞悬液。④以1∶3传代,37℃培养。⑤2~3d换液一次,3~5d形成单层。单层可维持8d。1.3.4细胞悬液的制备该细胞为非洲绿猴肾传代细胞。①选取单层致密,细胞界限清楚,透明度好的培养细胞。②倒去培养液,用无钙镁离子PBS溶液洗2~3次,用维尔希(Versene)消化37℃3min。③加入生长液(199和Eagle液各半,加10%小牛血清,常量青链霉素,pH7.2),吹打制成细胞悬液。④以1∶4传代,37℃培养,培养2~3d换液1次。⑤培养7d传1代。1.3.5消极主流细胞rpmi-1330该细胞为乳仓鼠肾细胞,经克隆筛选得纯细胞株。①选取长成单层的细胞,弃去旧的生长液。②吸取约1ml0.25%的胰蛋白酶液,37℃消化3min。③弃去胰蛋白酶液,加入RPMI-1640培养基(10%小牛血清,常量抗生素,pH7.0),吹打制成细胞悬液。④1瓶细胞可传2~4瓶,小方瓶每瓶加细胞悬液5ml,大方瓶每瓶加细胞悬液10ml。⑤37℃孵箱培养。1.4小鼠血清控制因子2.选取生长致密,透明度好,3~4d的单层细胞,用生长液制成细胞悬液(5.0×107/ml以上),内含二甲基亚矾8%~10%、小牛血清20%、青,链霉素100U和100μg/ml,分装于无菌1.5ml的细胞冻存管中,每支1ml。置4℃冰箱1h,取出,再放入-20℃低温冰箱1.5h,立即置液氮罐颈部15min,然后放进液氮罐内,长期保存。1.5采用二甲基亚采用细胞培养法将细胞从液氮罐内取出,立即在40℃水浴(C6/36蚊细胞在28℃水浴)中快速融化,启封后吸取细胞悬液,逐滴加入到新鲜配制的生长液中,置37℃(蚊细胞在28℃)温箱中培养。为了减少二甲基亚矾对细胞的毒性作用,次日换生长液继续培养。一般情况下,复苏后细胞传3代形态就可以恢复正常。2结果把登革病毒转染到上述细胞中。经传代培养后,在显微镜下观察到结果如下:2.1细胞培养细胞C6/36纯株经培养,在显微镜下观察,该细胞为类圆形,易于贴壁生长,但贴壁不牢,细胞在28℃培养。该细胞株对登革病毒的四个血清型(DEN-1,DEN-2,DEN-3,DEN-4)都能产生明显的细胞病变,使登革热病毒阳性率达到95%,此外该细胞株对第3期登革病毒组织培养技术·219·许多虫媒病毒敏感。2.2ap-61细胞经试验观察,对登革病毒的敏感性,稍低于C6/36细胞。2.3蚊细胞对检测结果影响形态为梭形,单层致密,维持时间较长,对登革病毒的分离和培养敏感性不如蚊细胞,一般产生CPE较迟或者不产生。因此,检出登革病毒缺乏明确指标,有时用干扰试验检出。该细胞适合做登革病毒的空斑试验。2.4维罗西亚细胞繁殖快,易于传代,对登革病毒敏感性不如蚊细胞和LLC-MK2细胞。2.521个细胞。13个细胞对登革病毒敏感性不如上述细胞。3细胞培养和给药登革热和登革出血热是由登革病毒引起的两种不同临床表现的急性传染病。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,据统计,该病是发病多、分布广、危害较大的一种虫媒病毒性疾病。在70年代前,对登革病毒的分离、鉴定,只在猴肾,地鼠肾等脊椎动物细胞上进行。但这些细胞对4个型的病毒敏感性不同,不能得到满意的结果。1968年Singh立了白纹伊蚊细胞株,后经Lgarashi克隆纯化,筛选出对登革热病毒敏感的C6/36细胞,对4个型的登革病毒都能产生明显的细胞病变,使登革病毒的阳性率达到95%。对这些细胞培养技术的建立有助于加速登革病毒的研究。不同种类的细胞需用不同的培养液、不同的消化方法和不同的传代比例进行传代;每种细胞所用的小牛血清需作培养试验,连传3代,如果细胞生长良好、单层致密、无细菌和支原体污染方可使用;C6/36蚊细胞培养时宜于28℃,接种登革热病毒后应置33~36℃培养,注意维持pH6.8~7.0;当实验室同时培养两种或两种以上细胞时,切勿同时传代,以免发生细胞间交叉污染。细胞培养技术比较复杂,需要反复练习才能熟