型登革病毒非结构蛋白ns1基因的克隆及表达

型登革病毒非结构蛋白ns1基因的克隆及表达

病毒登甲（dv-den）属于黄毒性。它分为四种类型：登上热、登陆出血热和休克综合征。登革病毒广泛流行于全世界100多个国家和地区,据WHO估计,目前全球每年约有5千万~1亿人感染登革病毒,近年来,我国南方频发该病毒的小流行,仅2002年广州和澳门地区就有近万人感染,其已经成为一种严重危害人类健康的蚊媒传播疾病,有必要给予足够的重视。登革热病毒的基因组编码3个主要结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1~5),其中NS1蛋白是登革病毒的重要非结构蛋白,有膜型和分泌型,包含群特异性和型特异性决定簇,具有多种T和B细胞抗原表位,能够诱发细胞免疫和体液免疫应答,已经证实在登革热病人的血清中存在循环NS1抗原和高水平的NS1特异抗体,NS1可能在机体的免疫保护和发病机制中发挥着重要作用。本研究结合我国广东地区登革病毒的流行多为Ⅰ型的特点,选取登革Ⅰ型病毒标准株非结构蛋白NS1基因片段在大肠杆菌中进行表达,获得具有良好免疫原性的重组蛋白,为其生物学特性分析、免疫学功能和血清学检测的研究奠定基础。1材料和方法1.1病毒和细胞登革热病毒Ⅰ型标准株和C6/36细胞为广州市CDC惠赠,大肠杆菌DH5α和M15均为本实验室保存。1.2病毒rna提取、rt-pcr和mem细胞培养液质粒pQE30表达载体、Ni亲和层析树脂购自QIAGEN公司,质粒pMD18-T克隆载体、病毒RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶等均购自TaKaRa公司。MEM细胞培养液购自GibcoBRL公司。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。1.3igm抗体检测临床确诊Ⅰ型登革病毒首次感染病人急性期血清10份由广州市CDC提供,并经澳大利亚PanBio抗体俘获ELISA试剂盒检测抗登革病毒的IgM抗体。1.4培养抗菌剂C6/36细胞在含10%胎牛血清MEM细胞培养液中于28℃、5%CO2条件下培养至单层,接入病毒液,静置吸附60min,吸去病毒液,加入含2%胎牛血清的维持培养液,于33℃、5%CO2条件下培养4d后收集培养上清。1.5bamh和cccaagctagacpta的构建取3ml病毒培养上清,按试剂盒操作提取病毒总RNA,最终用30μlDEPC水洗脱。取上述RNA液5μl加入45μl逆转录-PCR反应混合液中(含10×缓冲液MgCl25mM,dNTP1mM,RNaseInhibitor40U,AMVRTaseXL5U,AMV-OptimizedTaq5U),按以下条件进行反应:50℃逆转录30min,94℃灭活RNase2min后进入循环反应,94℃30s,58℃30s,72℃90s,共25个循环,72℃延伸7min,于4℃保温。使用的引物序列,上游引物:5’-CGGGATCCGATTCGGGATGTGTAA-3’,下游引物:5-CCCAAGCTTTGCAGAGACCATTGA-3’,其5’端分别携带BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。1.6表达载体的筛选胶回收纯化特异的NS1基因片断,与pMD18-T载体连接,经蓝白斑筛选、PCR及酶切鉴定,挑选阳性的pMD18-T/NS1克隆,以BamHⅠ和HindⅢ双酶切纯化回收后,与同样处理的pQE30表达载体经T4DNA连接酶16℃作用过夜,转化宿主菌M15,PCR及酶切鉴定筛选pQE30/NS1阳性克隆。实验操作详见分子克隆手册。1.7表达目的蛋白的诱导纯化挑取pQE30/NS1阳性M15克隆,IPTG诱导表达。分别进行不同诱导时间、诱导温度、诱导培养体系及不同IPTG浓度诱导实验,确立最佳的诱导表达条件后,诱导表达目的蛋白,用Ni-NTA树脂纯化。纯化方法按试剂盒说明书进行。SDS电泳对表达产物进行鉴定。1.8血清抗体检测将扩增的登革Ⅰ型病毒上清经56℃灭活30min,于透析袋中PEG6000包埋浓缩后,加完全福氏佐剂乳化,以皮下注射的方式接种新西兰大白兔,其后每间隔10天加强一次,为静脉免疫和皮下免疫途径交替进行,共免疫3次,在初次免疫前及每一次加强免疫前从兔耳缘静脉采血,分离血清,以检测兔免疫血清抗体效价。1.9羊抗兔igg二抗原螯虾血清定量表达包被纯化的NS1蛋白1μg/ml或培养的DV1病毒上清30μg/ml,封闭后,将稀释的血清加入反应孔中,37℃温育1h,加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG二抗,37℃反应30min,室温避光TMB显色10min,1MH2SO4终止反应后,测定A450值。1.10his单抗的制备取纯化后DV1NS1蛋白经10%SDS电泳分离后转移至PVDF膜上,用含10%脱脂奶粉PBS室温封闭2h后,分别加入按1∶100稀释的登革病毒感染病人血清、健康人血清、病毒免疫前后的兔血清和1∶800稀释的小鼠抗his单抗,一抗4℃结合过夜,洗膜后加入相应的HRP标记的羊抗人/兔/鼠IgG,室温作用1h,洗膜后,DAB显色。2结果2.1rt-pcr扩增登格1号病毒的ns1基因以提取的登革1型病毒总RNA为模板,扩增NS1基因,电泳分析显示在约1100bp处有一特异亮带,大小与预计相符,见图1。2.2重组质粒pqe-30/ns1的构建PCR回收产物直接克隆到pMD18-T载体中,转化后挑选阳性菌落,经PCR及BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定,均可获得1073bp左右条带,证实T-A克隆正确后,用BamHI及HindⅢ酶切获得NS1基因片段后定向插入pQE-30载体中,获得重组质粒pQE-30/NS1。重组质粒经PCR及酶切鉴定,均与预期结果吻合,见图2。2.3mol/liptg、30诱导的sds-东南角表达pQE30/NS1重组质粒转化的阳性克隆菌,通过表达条件的比较,确立了于LB培养体系,在1.0mmol/LIPTG、30℃诱导条件下,表达于4h达高峰。表达蛋白经SDS电泳示相对分子质量约为41000,与推测蛋白分子质量大小相符,所表达的蛋白约占总菌体蛋白的30%。经分离证实表达产物以包涵体形式存在,经8M尿素裂解后,用Ni亲和层析树脂进行纯化后获得较高纯度的重组蛋白,见图3。2.4免疫兔血清中抗dv1病毒和dv1-igg抗体的检测用NS1重组蛋白和全病毒建立的间接ELISA检测兔免疫血清,结果表明在第一次免疫后兔血清即产生特异的NS1-IgG和DV1-IgG抗体,加强免疫数次后,该两种抗体滴度均逐步升高,图4显示加强免疫3次后采血分别测定的兔血清中抗DV1病毒和DV1NS1蛋白的抗体滴度。2.5ternblot结果用病毒免疫兔血清及10份登革感染病人急性期血清分别与转至膜上的NS1蛋白反应,WesternBlot结果显示免疫兔血清以及2份病人血清在相对分子量约41000处有一明显阳性特异反应条带见图5,10份健康人血清在同样位置未见任何阳性条带。与his单抗结合作用后,在相应位置呈一致的特异显色带。结果表明,重组蛋白与免疫血清有良好的免疫反应性。3登革病毒感染中ns1-igg抗体的表达近年来,登革病毒的感染不仅在东南亚流行趋势加重,而且在世界许多国家和地区复燃,成为严重的公共卫生问题。但目前登革病毒感染尚无有效的防治措施,登革疫苗的研制也未取得突破性进展,早期检测诊断方法也正在逐步深入研究。本研究结合我国广东地区登革病毒的流行多为Ⅰ型的特点,通过构建原核表达载体,优化蛋白表达和纯化条件,成功获得重组的DV1NS1蛋白,并对其免疫学活性进行鉴定。ELISA及免疫印迹检测结果表明该重组蛋白与兔抗DV1全病毒多抗血清有良好的免疫反应性,而且在初次免疫后即产生特异的NS1-IgG抗体,表明了在登革病毒接种免疫的动物体内可激发较高滴度的特异NS1抗体,同时也提示在病毒结构成分中NS1具有较强的免疫原性。该重组蛋白还能被病人血清特异识别,虽然仅2例病人血清(发病的天数分别为5天和6天)可检测到特异的NS1-IgG抗体,但这可能和检测的血清标本均来自病人发病后1~6天,此时期病人血清中IgG抗体滴度尚未上升或/和首次感染的病人血清中NS1-IgG抗体滴度较低有关。近来对登革病毒感染的诊断研究趋向于早期的抗原检测,由于登革热患者一般无典型的临床症状,必须结合实验室检测加以确诊,建立一种早期简便特异的诊断方法尤为重要。已经证实在登革热病人的血清中存在高水平的循环NS1抗原。ShuPY等报道,在初次和二次登革病毒感染的病人急性期血清中均存在较高浓度的以免疫复合物形式存在的NS1抗原,在病程的2~4天达到峰值,因此,NS1有希望作为早期诊断的靶标应用于登革病毒感染的早期诊断。本实验在获得良好免疫原性的重组NS1蛋白的基础上,用于制备特异性的单克隆抗体,可以为早期检测患者血清中的NS1抗原奠定基础,此工作正在进