脑缺血-再灌注损伤的实验研究

脑缺血-再灌注损伤的实验研究

严重缺血后，不仅会导致严重的缺血器官损伤，还会导致远距器官损伤。如果严重，可能会导致多器官功能衰竭。脑本身缺血-再灌注(ischemia-reperfusion,I-R)损伤的研究倍受重视,但外周器官I-R对脑有无损伤作用则缺乏观察。研究表明,一氧化氮(nitricoxide,NO)介导脑I-R损伤,而诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)是NO过量生成的基础,iNOS-NO是否作为一种普遍机制也参与外周器官I-R引发的脑损伤尚未见报道。本文通过复制后肢I-R的大鼠模型,观察肢体I-R损伤对脑的影响,并通过脑组织iNOSmRNA、iNOS、过氧亚硝基阴离子(peroxynitriteanion,ONOO-)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)等指标的测定,以期从一个侧面探讨肢体I-R引发脑损伤的可能机制。材料和方法1细胞毒和抗凝剂栖热水生菌脱氧核糖核酸(thermusaquaticusdeoxyribonucleicacid,TaqDNA)聚合酶(上海生物工程公司)、禽成髓细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus,AMV)逆转录酶(Promega)、iNOS引物(上海生物工程公司)、β-actin引物(北京鼎国生物公司)、抗iNOS多克隆抗体(SantaCruz)、抗硝基化酪氨酸(nitrotyrosine,NT)单克隆抗体(Cayman)、过氧化物酶标记的链霉毒—亲和素试剂盒(ZYMED)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)(Sigma)、MDA、SOD测定试剂盒(南京聚力生物医学工程研究所)。SD大鼠,河北省实验动物中心提供。2动物脑损伤活性及免疫组化染色2.1实验分组与动物模型复制健康SD大鼠91只,体重200-215g,雌雄不拘。动物随机分为正常(N)组、假手术(S)组、后肢单纯缺血(I)组、后肢缺血-再灌注(I-R)2、6、12、18、24h各组。反转录-多聚酶链反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)实验用动物24只,每组3例;HE及免疫组化染色实验用动物20只,只观察N、S、I、I-R6h4组,每组5例;透射电镜实验用动物15只,只观察N、I、I-R6h3组,每组5例;MDA、SOD测定实验用动物32只,只测定N、S、I、I-R6h4组,每组8例。动物在20%乌拉坦(1g.kg-1,ip)麻醉下,暴露腹主动脉下段,以无创性动脉夹夹闭腹主动脉末端4h、开放2-24h分别复制I、I-R组模型。S组模拟I组手术过程但不夹闭血管,术后10h取脑。N组动物麻醉后直接取脑。2.2HE与免疫组化染色动物经主动脉插管灌注固定液(4%多聚甲醛,0.1mol/LPBS配制)后取脑,经后固定行石蜡包埋、切片,片厚5-6μm,在大脑连续冠状切片中,挑取尾状核、海马发达部位裱片(这些区域及皮质对缺血、缺氧等损伤敏感),分别作HE染色及以抗iNOS抗体、抗NT抗体为一抗的免疫组化染色,Olympus万能显微镜观察照像。免疫组化染色步骤为:切片常规脱蜡入水,3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,经抗原修复和正常血清封闭后,依次加入一抗(抗iNOS或抗NT)、二抗工作液、酶标链霉素-亲和素,DAB显色,棕色产物为阳性标记。两种免疫组化染色均设替代对照(以PBS代替一抗)。2.3透射电镜标本制备及观察动物经灌注固定液(多聚甲醛2%,戊二醛1.25%,0.1mol/LPBS配制)后取脑,以海马、皮质(顶部)为观察部位行二次取材,经后固定、锇化、脱水后,环氧树脂815包埋,超薄切片,铀一铅双重电子染色,日立H-7500型电镜观察摄影。2.4RT-PCR动物断头快速取脑(皮质与海马),常规提取脑组织总RNA,经逆转录反应制备iNOScDNA及内参对照物β-actincDNA。在两个相同的PCR体系中对iNOScDNA片段(430bp)及β-actincDNA片段(540bp)进行扩增。iNOSPCR条件:94℃45s、50℃45s、72℃45s,循环35次,72℃10min;β-actinPCR条件:94℃45s、55℃45s、72℃45s,循环30次,72℃10min。两种产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定用医学图像处理系统对条带进行灰度及面积扫描。将iNOS条带的灰度值与β-actin条带的灰度值的比值作为每例标本的iNOSmRNA半定量结果。2.5脑组织MDA含量、SOD活性测定动物断头快速取脑(皮质与海马)制匀浆提上清,按试剂盒说明书进行操作,全自动酶标仪(奥地利产)测消光值。MDA含量测定采用10%脑匀浆上清,其含量单位为μmol/L,SOD活性测定采用1%脑匀浆上清,其活力单位为103U/L。3统计处理实验结果以均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,组间比较采用t检验。结果1海马ca1ca2区光镜观察显示,S、I组脑组织与N组相比未见异常变化,I-R6h组,大脑皮质、丘脑、齿状回等区部份神经元胞体、胞核增大,胞浆及核密度下降,部分神经元核仁消失。大脑皮质部分锥体细胞、海马CA1区、CA2区部分神经元胞体明显变小,着色深,细胞周围出现水肿裂隙。海马各区放射层纤维纹理紊乱、扭曲。电镜观察显示,I组动物脑组织未见明显异常变化,I-R6h组神经元膜相系统受损较重,海马及皮质区组织中间、毛细血管周围、神经元核周可见水肿灶,神经元线粒体肿胀,峭紊乱、扩大、消失、空泡化,粗面内质网减少,髓鞘板层分离(图1:A、B,见加页Ⅰ)。2细胞组和抗nt阳性标记染色抗iNOS抗体标记染色显示,N组脑组织未见iNOS阳性细胞,S、I及I-R6h组脑组织均出现iNOS阳性标记的神经元及小胶质细胞,S、I组阳性细胞分布于皮层后肢区、尾状核(伤害性刺激的感受、调制中枢)区,I-R6h组iNOS阳性细胞分布比S、I组广泛,见于皮层各区、海马、尾状核等区。抗NT抗体标记染色显示,I-R6h组皮层、海马、尾状核等区有弥散分布的NT阳性标记细胞。I组偶见少量NT阳性细胞(图1:C、D,见加页Ⅰ)。3nosmrna表达量N组未检出iNOSmRNA,其它各组脑组织均有iNOSmRNA表达,其中,S组表达较弱,I组较S组增强,再灌2h组明显高于I组,6h表达量最大,此后衰减,再灌24h仍有少量表达(图2、3)。4各组小鼠sod活性的比较I-R6h组MDA含量显著高于N、S、I组,SOD活性显著低于这些组;S、I组SOD活性及MDA含量与N组比较无显著差异(表1)。研究肢体i-r活性的变化本实验证实,肢体I-R对脑组织有损伤作用,其机制可能涉及:创伤应激;夹闭腹主动脉引起的血流动力学改变;肢体I-R为始动因素,通过某种机制引起脑损伤等方面。在本实验中,S、I组脑组织未出现明显的病理改变,其MDA含量与N组相比无显著差异。另据BengisunU报道,夹闭腹主动脉引起的血流动力学改变是一过性的,对心功能无明显影响。我们认为,本实验的手术创伤及夹闭腹主动脉造成的血流动力学改变不是肢体I-R所致脑损伤的重要因素,而I-R6h组MDA含量较N组显著升高的结果提示,氧化应激可能是肢体I-R所致脑损伤的重要机制之一。研究证明,NOS-NO参与了脑缺血-再灌注损伤的发病过程,高浓度的NO具有神经毒性。NO毒性的强弱不仅与浓度有关,还取决于内环境中活性氧的水平。NO与超氧阴离子(O∸22∸)能快速结合生成ONOO-,后者的氧化性较NO及O∸22∸更强。ONOO-能与半胱氨酸、谷胱甘肽之巯基发生不可逆反应;能使SOD等活性蛋白的酪氨酸硝基化;还能强烈抑制线粒体的呼吸功能。现在认为,NO的细胞毒效应主要由ONOO-介导。肢体I-R后血液中氧自由基急剧上升,脑组织中包括O∸22∸在内的活性氧处于较高水平,如同时有NO生成增多,将与O∸22∸快速反应生成大量的ONOO-。因此,证明肢体I-R后脑组织内是否有NO大量产生是本研究的关键问题。我们应用RT-PCR及免疫组化染色方法分别在基因转录和蛋白合成水平证实,肢体I-R后脑组织iNOS表达明显上调,表明肢体I-R后脑内有NO大量生成。用特异性的NT单克隆抗体对ONOO-的标志性产物NT进行标记染色,结果显示,I-R组脑组织内有大量NT阳性标记细胞,说明在肢体I-R过程中脑内有ONOO-过量生成。本实验I-R6h组脑组织SOD活性显著下降可能