登革病毒病的诊断与防治

登革病毒病的诊断与防治

病毒登格病毒（dad）是黄病毒属的一种单带正链rna病毒。在5c-pm模式下，编码了三种结构蛋白和七种非结构蛋白。从5c-iiic-prm（m）-e-ns1-ns2a-ns3-ns4a-ns5-3。根据E蛋白的抗原性不同,它分为4个血清型(DV1~4)。DV主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,引起人类登革热(classicaldenguefever,DF)和登革出血热/登革休克综合征(denguehaemorrhagicfever/dengueshocksyndrome,DHF/DSS)。对DF的发病症状早在18世纪就有记载,但在相当长的时间里人们并不了解其病因及流行来源。几个世纪以来,世界各地陆续有此病流行的报道,但真正分离到病毒还是在20世纪40年代。自上个世纪80年代以来,DF和DHF/DSS在世界范围的流行及暴发更加频繁。我国自1978年以来,在沿海地区如广东、广西、海南、福建、台湾等地均暴发过DF及DHF/DSS。据报道,DV每年感染约1亿人,其中DHF/DSS患者约有50万人,病死率为5%~10%,如未及时治疗,可上升至50%。近年来,在我国南方及东南亚,DHF/DSS的发病率有明显增加之趋势,已成为严重的公共卫生问题。然而,由于DV有4个血清型,且目前尚无理想的疫苗问世,预防仍主要依赖于对蚊媒的控制。因此,阐明DV进入靶细胞的分子机制及致病机制,从中寻找有效的防治方法是当今迫切需要解决的问题。靶细胞上DV特异性受体的研究是近几年关注的热点,现就此作一综述。病毒受体概念病毒受体是宿主基因组编码、控制和表达的一组蛋白质,它参与病毒与靶细胞的相互作用,使病毒吸附在细胞表面。在病毒受体的介导下,病毒最终进入细胞进行复制。细胞上的病毒受体的特异性决定了病毒的宿主范围和组织亲嗜性。过去认为病毒与细胞的相互作用是通过病毒的某个成分——病毒吸附蛋白(virusattachmentprotein,VAP)直接识别或结合到细胞表面的单个分子上。近年来相继分离出了多种病毒的受体,同时在病毒受体的本质及病毒和受体相互作用机制等研究方面也取得了很大的进展。目前认为,病毒与受体的结合是一个多步骤过程,涉及不同的病毒吸附蛋白及多个靶细胞受体。细胞表面的病毒受体可以是特异性的,也可以是非特异性的;病毒可能与一个以上的细胞表面分子结合,且同一病毒与不同细胞所结合的受体可能不同。DV包膜E蛋白病毒对细胞的嗜性与VAP结合特异性细胞受体的能力有关,E蛋白是DV的结构蛋白,位于DV的表面,有494个氨基酸及2个潜在的糖基化位点,是病毒颗粒的主要包膜蛋白。登革病毒感染的早期现象是病毒的吸附及穿入,而E蛋白对这些过程均有影响,并能影响病毒毒力和细胞嗜性,其序列中第98~111位的氨基酸构成了一个与融合及变构相关的结构域,因而被认为是登革病毒的VAP。此外,它有与中和抗体及血凝素抑制抗体反应的抗原决定簇,同时具有型特异性抗原决定簇。Modis等通过对DV2型E蛋白晶体结构的研究认为,E蛋白的三维结构如下:E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不同的区域,Ⅰ区是一个β桶状中心结构,由氨基端及羧基端序列产生;Ⅱ区形成一个延伸的指状结构,可能与E蛋白二聚体的形成及膜融合过程相关;Ⅲ区为IgG免疫球蛋白样折叠,可能存在一个三角形的受体结合环,因而在病毒与宿主细胞之间相互作用中发挥着重要的功能。同时,DV与特异性细胞受体的结合依赖于E蛋白的二聚体结构,在低pH值的条件下,E蛋白的构像发生改变,由二聚体形成三聚体,随后病毒包膜与细胞膜融合,进而促进DV对细胞的感染。此外,Modis等通过晶体结构的研究还认为,登革病毒E蛋白存在一个配体结合“口袋”,结合疏水的配体,它影响在低pH值条件下,E蛋白发生变构介导膜融合的过程,其作用的发挥通过Ⅰ、Ⅱ区结合面的一个发卡结构来控制配体结合“口袋”的开合,当配体结合“口袋”打开时,与膜融合相关的结构域暴露在外,反之则相反。因而可以利用这一点设计一个小分子物质与配体结合“口袋”结合,阻止E蛋白发生变构,使膜融合不能发生。DV受体有关DV病毒受体的研究刚刚起步,目前认为DV受体包括糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)、与脂多糖连接的CD14相关分子等,研究大都采用体外传代的细胞系及病毒重叠蛋白结合测定法(virusoverlayproteinbindingassay,VOPBA),测定病毒是否结合到所分离的蛋白上。1.dv2和行激素2在细胞表面功能的互动关系探讨糖胺聚糖是由二糖重复单位(氨基己糖、己糖醛酸或半乳糖)组成的线性杂多糖,其重复二糖骨架的化学结构,广泛存在于细胞膜和细胞外基质。GAGs由细胞合成后分泌到细胞外,并能与细胞膜上的细胞外基质受体结合。实际上细胞外基质是细胞分泌物在细胞附近构成的精密网络。组成GAGs的二糖单元中有一个糖残基必定是氨基糖,即N-乙酰葡糖氨或乙酰半乳糖胺,氨基糖大都硫酸化,另一个糖残基多为糖醛酸。根据糖残基的性质、连接方式、硫酸基的数量和存在的部位,GAGs一般可分为四类:透明质酸(HA)、硫酸软骨素(CS)/硫酸皮肤素(DS)、硫酸角质素(KS)及硫酸乙酰肝素(HS)/肝素。GAGs可与蛋白质共价结合,形成蛋白聚糖,其功能由核心蛋白和GAGs的性质决定。核心蛋白穿越脂质双层或通过葡糖磷脂酰肌醇与脂质双层结合。如成纤维细胞和上皮细胞的质膜中一种称为联合素的蛋白聚糖,它与整合素一样,是细胞外基质的受体蛋白,其核心蛋白穿膜,细胞外区连有HS,细胞内区与皮层中的肌动蛋白丝相接。因此推测质膜中的蛋白聚糖的一个重要功能就是作为细胞表面的辅受体,与细胞表面的适当受体协作,参与某一生理或病理过程。Chen等及Rostand等经过研究DV2与Vero细胞之间的相互作用,认为DV与表达在基质及细胞膜上的GAGs的结合介导了病毒的吸附,同时通过对E蛋白与GAGs的结合序列进行预测(在富含碱性氨基酸的区域找出被转角分开的某个区域,它们若对合在一起则认为是GAGs结合序列),得出结论为,E蛋白具有2个GAGs结合区:E284~310氨基酸,位于Ⅰ区侧面及Ⅲ区的终端;E386~411氨基酸,位于Ⅲ区尾部,与前者的C端共同形成暴露在外的受体结合位点。Germi等证明用GAG——裂解酶除去Vero细胞的GAGs后,DV2与细胞的结合率降低,同时用DV2结合GAG表达缺陷的两株CHO细胞发现,细胞株psgb168(半乳糖基转移酶1缺陷,硫酸软骨素合成障碍)和细胞株psgd677(硫酸乙酰肝素表达缺陷,但其余的GAGs表达增高)与DV2的结合率,均比野生型下降了75%以上。Bielefeldt-Ohmann同时对两株与DV2高度亲和的人白细胞株(髓单核细胞系HL60及非EBV转化的B细胞株BM13674)的研究也得到相似结果。目前认为,GAGs参与DV与靶细胞的相互作用,但可能不是唯一方式,换言之,GAGs不是DV感染细胞所必需的,还有其他因素的参与。2.dv与hs的关系硫酸乙酰肝素(HS)是GAGs的一种,因在DV吸附和进入靶细胞过程中起重要作用而受关注。HS是一种高度硫酸化的氨基葡聚糖,一级结构为重复的二糖单位,双糖中的残基可形成硫酸酯,广泛存在于细胞表面及细胞基质。Germi等发现,用含氯酸钠(硫酸化抑制剂)的培养基培养Vero细胞,细胞的存活并不受影响,但细胞与E蛋白的结合被抑制,抑制率可达80%,据此认为,HS是DV受体,且HS的硫酸化对E蛋白与受体的结合是必需的。此外,因为肝素与HS同源,两者的糖基相似,研究大都利用肝素来分析HS的作用。Hilgard等用500μg/ml肝素预处理DV1,可抑制病毒与人肝癌细胞株HuH-7的结合,拮抗率达75%;同时实验还证明,DV吸附和进入肝细胞可能是通过其细胞表面的相对分子质量为33×103和37×103两种与HS相连的蛋白聚糖,而DV的表面可能有HS的结合位点。Germi等将Vero细胞用肝素裂解酶1(对HS和肝素高度硫酸化的结构域有特异性作用)和软骨素ABC裂解酶(对软骨素和硫酸软骨素起作用)在37℃处理1h,肝素裂解酶处理组显著抑制了病毒的感染,肝素浓度越高,病毒结合率越低,拮抗率可达60%~70%,肝素的半数抑制剂量(ID50)为0.2μg/ml。Lin等通过实验也证明,肝素可抑制DV2对5种人肝细胞系细胞株(HuH-7、HA22T、Hep3B、PLC、Changliver)的感染作用。另外Martinez-Barragan等发现,Vero细胞上另一种糖蛋白也与DV的吸附有关,且这一途径不受HS的影响,提示参与DV感染的膜蛋白可能不是单一的分子,可能有其他高亲和的受体存在,且不同细胞发挥受体作用的分子可能不同。综上所述,可以看出DV与HS之间的作用是复杂的、多因素的,与病毒株、细胞株、细胞的传代数以及细胞表面HS的分布均有关系。目前较为合理的解释是HS使DV粘附至细胞上,使得DV易与细胞表面高特异性和高亲和力受体结合,并最终介导DV进入细胞。3.脂多糖受体的结构Chen等认为,单核细胞和巨噬细胞表面高度表达的CD14与DV的进入有关。CD14是一种糖蛋白,也是脂多糖的主要受体,它与葡萄糖磷脂酰肌醇相连,在单核细胞和巨噬细胞的质膜中高度表达。实验证明,在感染DV前加入脂多糖能有效阻止病毒感染,可能是影响了病毒进入细胞这一过程;但在实验中也发现,用单克隆抗体阻断CD14后再加入脂多糖,并不能影响DV的感染。据此认为位于单核细胞和巨噬细胞表面的脂多糖受体由两部分组成:与葡萄糖磷脂酰肌醇相连的CD14和目前未被证实的作为共受体的跨膜蛋白(见图1)。在缺乏脂多糖的条件下,DV直接通过这种未知的受体进入细胞;在脂多糖存在的条件下,脂多糖与CD14和未知受体相连,从而阻止病毒进入;用抗CD14的单克隆抗体将其阻断,使脂多糖不能与之相连,DV便可通过此种未知受体进入细胞。4.dv与fc受体的关系除上述受体外,目前通过感染对DV易感的靶细胞,利用VOPBA方法,初步推断出一些DV受体分子。DV2受体分子包括:K562细胞表面的相对分子质量为100×103蛋白、白纹伊蚊C6/36细胞表面的相对分子质量为67×103和80×103蛋白、N1E-115(神经母细胞瘤细胞)和SK-N-SH(人神经母细胞瘤细胞)表面的一种对胰蛋白酶敏感的相对分子质量为65×103蛋白;DV4的受体分子包括:C6/36细胞表面的相对分子质量为40×103和45×103糖蛋白、Vero细胞表面的相对分子质量为74×103蛋白。但这些研究仅限于证明了可能作为受体的膜蛋白的相对分子质量,对于它的性质等还有待于进一步阐明。此外,单核-巨噬细胞表面的免疫球蛋白G(IgG)的Fc受体可能也是DV的受体之一。DV初次感染产生的非中和抗体或较低水平的中和抗体与二次感染的不同型别的DV,形成抗体-病毒复合物,通过IgG的Fc段与单核-巨噬细胞表面的Fc受体结合,促进病毒对细胞的感染并在其中大量增殖,同时激活CD4+和CD8+T细胞产生大量的细胞因子,造成炎症反应加重,引起免疫病理损伤,导致DHF/DSS。研究证明,在大量DHF病例中可见TNF-α、IL-6等细胞因子的明显升高,而TNF-α可进一步诱导IL-6、IL-8、IL-10等细胞因子的产生。这些促炎性细胞因子可引起趋化肽等释放,还可使内皮细胞活化而导致血管通透性增加,以及血凝/纤溶系统功能障碍。这一学说解释了DHF/DSS患者表现出的血小板减少及血液浓缩等现象,但不能解释DV是如何感染血液中无DV抗体的人群,也不能说明DV是