亚甲蓝、伊文思蓝、中华墨汁对鼠肢体淋巴结的皮下注射

亚甲蓝、伊文思蓝、中华墨汁对鼠肢体淋巴结的皮下注射

四肢粘膜水肿，尤其是乳腺癌手术的淋巴结水肿，是一种常见的并发症。鼠是研究肢体淋巴管再生常用的实验动物,其中,淋巴管与淋巴结示踪是研究淋巴管再生的实验基础。在以往的研究中,有关鼠肢体淋巴结的示踪显色时间报道不一,从几分钟到几小时不等。准确确定淋巴结显色时间能够及时观察显色淋巴结,有利于后续实验的进行。本研究选择常用的淋巴示踪剂亚甲蓝、伊文思蓝及中华墨汁,对大鼠和小鼠肢体淋巴结显色的准确时间及其淋巴管走行进行统计和观察,从而为淋巴结相关研究奠定基础。1材料和方法1.1试验对象成年Wistar大鼠18只,雌雄不限;成年KM小鼠18只,雌雄不限,均由山东大学动物实验中心提供。1.2浓度1.0%的溶液淋巴结示踪剂:0.2mg/mL亚甲蓝(江苏济川制药集团公司生产);伊文思蓝(Evan’sblue,上海如吉生物技术有限公司),以0.1g用10mL生理盐水配制成浓度1.0%的溶液;中华墨汁(北京一得阁工贸中心生产),用生理盐水配制成1.0%的溶液。10%的水合氯醛。1.3皮肤主动活检1)将动物分成亚甲蓝组、伊文思蓝组和中华墨汁组,每组6只。每组中活体3只,尸体3只。2)活体组大鼠用10%的水合氯醛麻醉,剃除四肢毛发,酒精消毒,沿一侧前肢内侧(掌面至腋窝)和后肢内侧(足底至腹部)做切口,分离皮下组织,暴露深筋膜。然后将皮肤向两侧牵拉、展开以便于之后显示淋巴管和淋巴结。尸体组大鼠用断头法处死,半小时后作上述解剖。活体组和尸体组小鼠的处理同上。1.4颜色和观察1.5统计处理用亚甲蓝、伊文思蓝及中华墨汁染色后,统计肢体淋巴结显色所用时间、被染淋巴结数目并观察肢体淋巴管走形。实验数据以ue0af±s表示。2结果2.1各组小鼠血清中的髂淋巴结显色时间1)亚甲蓝:活体组大鼠亚甲蓝从掌面到腋淋巴结的平均显色时间为(11.3±0.6)s,尸体组为(12.5±1.1)s;3~4条淋巴管自掌面沿前臂外侧深筋膜深面至肘部,后经上臂外侧转内,止于肱三头肌和背阔肌之间的腋附属淋巴结和背阔肌与胸大肌之间的腋固有淋巴结。从足底注射染料后,腘淋巴结显色时间为5~6s,髂淋巴结平均显色时间为(11.7±0.6)s,尸体组为(13.3±0.6)s;2~4条淋巴管沿小腿外侧深筋膜深面输入腘窝处的腘淋巴结,后者的输出管穿大腿肌并与股动脉伴行经腹股沟韧带下方至盆腔内的髂淋巴结(表1)。2)伊文思蓝:活体组伊文思蓝对前肢和后肢淋巴结平均显色时间分别为(11.3±0.9)s和(11.5±1.1)s,尸体组分别为(12.0±0.4)s和(13.0±0.4)s。3)中华墨汁:活体组中华墨汁对前肢和后肢淋巴结平均显色时间分别为(11.8±0.9)s和(12.3±0.1)s,尸体组分别为(13.0±0.4)s和(13.7±0.6)s。前肢腋窝检出淋巴结2个,后肢腘窝检出淋巴结1个,盆腔内检出淋巴结1个。2.2两组患者血清中淋巴结的显色时间1)亚甲蓝:活体组亚甲蓝从掌面到腋淋巴结的平均显色时间为(4.3±0.2)s,尸体组为(6.2±0.5)s;1~2条淋巴管自掌面沿前臂外侧深筋膜深面至肘部,后经上臂外侧止于腋部皮下和背阔肌之间的腋淋巴结。从足底到髂淋巴结和腹股沟淋巴结的平均显色时间为(5.8±0.5)s,尸体组为(6.8±0.5)s;1~2条淋巴管沿小腿外侧深筋膜深面输入腘窝处的腘淋巴结,后者的输出管沿大腿肌上行经腹股沟韧带下至腹主动脉末端的髂淋巴结,同时淋巴管沿后肢外侧到达荐椎左侧的荐淋巴结。2)伊文思蓝:活体组伊文思蓝前肢和后肢淋巴结的平均显色时间分别为(4.7±0.2)s和(5.8±0.6)s,尸体组分别为(5.7±0.5)s和(6.5±0.4)s。3)中华墨汁:活体组中华墨汁前肢和后肢淋巴结的平均显色时间分别为(5.2±0.2)s和(6.2±0.5)s,尸体组分别为(5.8±0.2)s和(7.0±0.4)s(表2)。前肢腋窝检出淋巴结2个,后肢腘窝检出淋巴结1个,盆腔内检出淋巴结1个,荐椎皮下检出淋巴结1个(表2)。3小鼠淋巴结显色时间的确定毛细淋巴管与毛细血管结构不同,毛细淋巴管壁的内皮细胞间隙较大且缺乏完整的基膜,因此,淋巴管具有引流组织间隙大分子物质或微粒的特性。亚甲蓝、伊文思蓝等染料作为大分子物质,稳定性较高,可以通过毛细淋巴管内皮间隙进入淋巴管到达淋巴结,常被用作淋巴结的示踪。常用淋巴管示踪剂分为染料和同位素两大类。染料示踪剂有伊文思蓝、亚甲蓝、中华墨汁、专利蓝(patentblue)、活性炭等;同位素示踪剂即放射性核素标记物如99mTc、131I等。比较而言,染料染色显影法操作方法简单、直观、安全,染色成本低,临床上常用于显示肿瘤组织如乳腺癌、大肠癌、胃癌的前哨淋巴结,以评估肿瘤细胞的转移情况和制定相应的手术方案。鼠是研究淋巴管再生或淋巴结移植等常用实验动物,常用染料示踪剂显示鼠淋巴结和淋巴管。在以往的研究中,对大鼠的肢体淋巴结显色时间的描述存在差异。蔡仁祥等用中华墨汁染色,24h后观察SD大鼠腘淋巴结;用美蓝染色,10min后观察腘淋巴结。张有成等在分别注射专利蓝脂质体后1h观察到大鼠腘淋巴结。同样,在小鼠的相关研究中,张宝昌等注射墨汁后30~60min进行解剖,观察到肢体淋巴结;而Maria.I.Harrell等用伊文思蓝注射足部后发现髂淋巴结在15min内即可显色。我们先剖开鼠足掌部以上的皮肤,再于足掌部注入染料,记录淋巴结显色的准确时间。结果显示,足掌部的染料沿淋巴管迅速到达局部淋巴结:活体大鼠前肢腋区的淋巴结显色时间为10~12s;后肢腘窝内腘淋巴结显色时间为5~6s,髂淋巴结显色时间为11~13s。尸体大鼠的显色时间与活体相近。活体小鼠前肢腋区淋巴结显色时间为4~5s,后肢髂淋巴结和荐淋巴结显色时间为5~6s,尸体小鼠的显色时间与活体相近。上述结果意味着局部注射染料后即可解剖观察淋巴结。准确确定淋巴结显色时间有利于显色淋巴结的及时观察和后续实验的进行,提高实验效率。实验中我们总结了鼠肢体淋巴引流通路。大鼠前肢3~4条淋巴管自掌面沿前臂深筋膜至肘部,后于上臂转至位于背阔肌附近的腋淋巴结;小鼠前肢1~2条淋巴管自掌面沿前臂深筋膜至肘部,后于上臂外侧至腋部皮下和背阔肌之间的腋淋巴结。大鼠后肢2~4条淋巴管沿小腿外侧深筋膜输入腘淋巴结,后者的输出管穿大腿肌经腹股沟韧带下方至盆腔内的髂淋巴结;小鼠后肢1~2条淋巴管沿小腿外侧输入腘淋巴结,后者的输出管经腹股沟韧带下至腹主动脉末端的髂淋巴结。分析本组示踪淋巴结,如下因素可影响淋巴结的显色时间:1)注射位点的选择。注射位点的选择很大程度上决定淋巴结染色,Maria.I.Harrell等对小鼠背部注射染料后半小时后仍未发现染色的淋巴结,认为淋巴管对此范围的引流甚少。相比之下,鼠掌和足底皮下组织液丰富且毛细淋巴管较多,为快速引流提供了良好的基础。2)染料的浓度。徐鲲等研究得出,浓度为1.0%~10.0%的中华墨汁对家兔乳腺癌前哨淋巴结染色效果好,特异性较高,且不影响病理组织学观察。高浓度的染液的颗粒由于未完全分开,造成颗粒直径大于毛细淋巴管内皮细胞间隙,而很难进入淋巴引流。3)染料用量。用量太少会造成局部压力小,也是造成显色时间相对长原因之一。我们选择合适的注射位点、适当的染料浓度和用量进行实验,结果发现肢体淋巴引流迅速,淋巴管的引流路径清晰可见。这不仅为示踪其它淋巴结提供了有用