抗体依赖增强感染效应在登革病毒致病机理中的应用

抗体依赖增强感染效应在登革病毒致病机理中的应用

病毒位于黄毒科，分为四种类型（denv-1、denv-2、denv-3和denv-4）。每个血清素组的同源性为65%70%。DENV主要通过埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白纹伊蚊(Aedesalbopictus)等昆虫媒介传播。全球热带亚热带地区有25亿人口面临着被感染的危险。据估计,每年有5000万～10000万人被感染,其中50万人为严重感染,死亡人数约1.5万。人体初次感染DENV时,可能只引起隐性感染而无登革热的典型症状,并且可获得对同型病毒的长久免疫力。但四个血清型的DENV之间缺乏交叉免疫保护作用,人体二次感染其他型别的DENV时将易发生症状更为严重的登革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(Dengueshocksyndrome,DSS)。关于登革病毒二次感染引起更为严重疾病的机制目前尚未阐明,但大多数学者认可Halstead等于1977年提出的抗体依赖增强感染效应(Antibody-dependentenhancement,ADE)。即机体感染某一血清型的DENV后,当机体再次感染其他血清型的DENV时,由于抗体与异型病毒的亲和力较低及其在体内浓度的下降,不但无法中和病毒,反而会引起自身Fc段与体内含有Fc受体的细胞表面结合,使得病毒在细胞表面聚集,增强了病毒对细胞的感染能力。在随后的30多年中,开展了大量关于ADE的研究。1研究ade对细胞和动物模型的影响1.1细胞系的表达研究发现很多原始细胞和细胞株均可以被DENV感染,其中有单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、内皮细胞、肝细胞和中性粒细胞等。体外试验常用的细胞株有:K562细胞株(人类白血病细胞株,可表达FcγRⅡa、DC-SIGN,类似于成熟的树突状细胞)、THP-1细胞株(人类单核细胞传代细胞系)、U937细胞株(人类单核细胞株)、人淋巴细胞瘤B细胞株、人原始单核细胞源性的巨噬细胞等。通过对不同类型的细胞进行研究发现,能够产生ADE的细胞需在其表面表达Fc受体,并证实人体内可产生ADE的靶细胞为单核细胞、巨噬细胞和成熟的树突状细胞等。1.2denv感染小鼠模型建立小型动物模型对于研究DENV感染是非常必要的,可用于宿主免疫机制、疾病病理、相关药物和疫苗等方面的研究。在过去的几十年里人们一直尝试建立DENV感染的动物模型,但是大部分动物被证实对DENV感染有抵抗力。所以,到目前为止还没有建立能够完全反映重症DENV感染时病情进展的动物模型。前已发现灵长类动物和小鼠体内可发生ADE。近几年多数学者致力于小鼠模型的建立。最初尝试建立小鼠模型时,需要高剂量的病毒,并且不能体现人体感染DENV过程中的病毒在外周组织中的复制、机体感染DENV出现ADE后特征性症状的演变等。后来,人们发现免疫功能严重不全的小鼠可被DENV感染,例如:BALB/cnu/nu无胸腺裸鼠和RAG1-/-小鼠等,但其症状与人类不同,往往死于瘫痪而非人体出现的血管通透性改变。近年来建立小鼠模型的另一种方法是:人工将人外周血淋巴细胞或者对DENV敏感的肿瘤细胞植入小鼠体内,使其成为严重免疫缺陷小鼠,作为候选的DENV感染小鼠模型。例如,SCID小鼠即重症联合免疫缺陷综合症(Severecombinedimmunedeficientdisease,SCID)小鼠,是由C.B-17近交系小鼠的16染色体的单个隐性突变基因所致。该小鼠由于T、B细胞功能均缺乏,对移植入其体内的异种组织细胞排斥反应较弱。将白血病细胞株K562细胞移植入SCID小鼠后,制成了对登革病毒敏感的SCID-K562小鼠模型,可用来检测不同血清型DENV的毒力以及抗体对DENV感染的保护作用。但由于SCID-K562小鼠免疫功能不健全,而免疫病理反应是DHF、DSS的主要病因之一,导致SCID-K562小鼠作为DENV感染动物模型存在一定的局限性。随着此类人源化小鼠模型的发展,对已建立的非肥胖型糖尿病和严重免疫缺陷小鼠模型又重新进行了探索,发现在DENV-2皮下注射时,可重复人体感染时出现的病毒血症。然而,由于人体和小鼠宿主本身免疫系统的差异以及此类人源化小鼠存在严重的免疫缺陷,有可能不能准确体现人体感染DENV时免疫调节的变化,限制了对DENV感染时免疫应答调节的研究。此外,这类小鼠来源少,花费较高,这限制了大规模的应用研究。随着对干扰素(IFNs)研究的增多,尤其是在发现IFNs在控制病毒感染中起重要作用之后,越来越多的研究者开始关注IFNs及其受体的研究并用于动物模型的建立。Johnson等最早建立了DENV感染的AG129小鼠模型。Shresta等通过比较发现,敲除IFN-α/β受体基因及IFN-γ受体基因的小鼠更适合于研究早期DENV在外周组织中的复制和随后的疾病发展。由于免疫缺陷的存在,AG129小鼠模型可用于DENV感染后的功能性免疫调节系统研究。四种血清型的DENV均可感染AG129小鼠,并且病毒可以在与人体相对应的细胞和组织中复制,在DENV感染时可表现出抗体保护作用和抗体增强作用。因此,此模型可以用来验证最初主要通过流行病学观察得出的ADE假说,说明体外实验结果和体内免疫功能调节系统的作用。随后,Zellweger等通过被动免疫AG129小鼠,研究分析了婴儿发生DHF/DSS的机理,发现小鼠肝窦上皮细胞可产生ADE效应。Balsitis等发现小鼠体内致命性的抗体增强DENV感染可以被抗体变异体(E60-N297Q,不能结合Fcγ受体)阻断。这两项研究均证实了AG129小鼠作为研究DENV动物模型的可行性。有可能是由于小鼠和人类细胞之间的差异,AG129小鼠模型仍不能完全重复人体感染DENV后的疾病发展过程。2ad-de效果的影响机制2.1血清型抗体与deBalsitis等在利用AG129小鼠研究重症DENV感染作用机制时发现,腹腔注射抗病毒血清后的小鼠全身病毒量增加,表达Fcγ受体细胞的感染量增加,从而加重了病毒感染。其机制可能为当机体再次感染某种血清型(与初次感染血清型不同)的DENV时,由于体内抗体浓度低于中和浓度,且对异型病毒的亲和力较低,特异性的单克隆抗体不但无法中和病毒,反而可以形成感染性的免疫复合物与细胞表面的Fc受体结合,从而促进病毒进入细胞。Rothman进一步发现,DENV二次感染与第一次血清型不同时,具有交叉活性的抗体可介导严重的DENV感染;而两次感染的DENV血清型相同时,血清型特异性的抗体会保护机体免受同种病毒的再次感染。而Balsitis等还发现,即便两次感染的DENV血清型相同,在体内特异性抗体浓度较低的情况下也会出现ADE现象。在另一个使用AG129小鼠模型的试验中,病毒-抗体复合物与Fcγ受体相互作用导致病毒水平升高,并且发现肝窦上皮细胞是小鼠体内唯一表现出ADE的细胞。事实上,多次感染不同血清型DENV后造成ADE的情况更加常见。新生儿从母体得到多克隆抗体,同时由于体内抗体浓度低于中和浓度,在初次感染登革病毒时即可出现严重的症状。近期Dejnirattisai等通过对抗非结构蛋白1抗体、抗包膜蛋白抗体和抗前膜蛋白(precursor-membraneprotein,prM)抗体进行比较分析发现,只有抗prM抗体在抗体低浓度和高浓度的情况下均产生ADE。继而通过使用昆虫卵巢SF9细胞株及人单核细胞对抗prM抗体的中和作用和增强感染作用进行研究比较,推测病毒表面部分裂解的prM可减少病毒表面的可产生中和病毒抗体的抗原密度,使DENV在存在抗prM抗体时更容易产生ADE。最近通过对28名初次感染或者二次感染的患儿恢复期早期或晚期的外周血中特异性B细胞的研究发现,在初次感染时,针对DENV包膜E蛋白的B细胞具有高度血清型特异性,而在二次感染过程中,大部分此类细胞则具有血清型交叉活性,并且分泌能中和不同血清型DENV的抗体。这些针对DENVprM和E蛋白抗体的新发现为今后ADE的研究提供了新思路。2.2denv感染后细胞的表达和免疫调节作用由上述研究可见,在人体二次感染DENV时,细胞表面的Fc受体或者是病毒包膜蛋白可能通过促进病毒进入细胞产生ADE效应。此外,有研究发现AG129小鼠发生ADE时会引起血管通透性增加,血小板减少,血细胞比容增加,导致以胃肠道出血、早期死亡为特征的严重疾病。与此同时,小鼠体内病毒载量增大,细胞因子浓度也发生变化。Vaughn等发现患儿胸水产生量占胸腔的体积百分率与病毒载量峰值变化一致,说明血管通透性的改变与病毒载量的变化相一致。同时发现,初次感染DENV的患儿与二次感染的患儿相比,虽然后者病毒载量高,但病毒血症持续时间短,可见体内存在抗体时,机体通过免疫反应可迅速清除病毒。在迅速清除病毒的同时,胸水产生量占胸腔体积百分率明显高于初次感染,病情较初次感染重,可见在DENV二次感染时血管通透性的改变主要是由于宿主的免疫反应引起的,而并非病毒直接造成的损伤,宿主免疫应答反应的改变则主要体现在细胞因子浓度的变化上。有研究发现DENV感染后维甲酸诱导基因-I(Retinoicacid-induciblegene-I,RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(Melanomadifferentiationassociatedgene5,MDA-5)、IFN-β表达上调,但是在被DENV感染发生ADE的细胞中,这些蛋白质的诱导被抑制。同时,在上述细胞中,IL-10和细胞因子信号抑制因子3(Suppressorofcytokinesignaling3,SOCS3)的表达大幅度上升。并发现与轻度登革热患者相比,登革出血热患者的外周血单核细胞(PBMCs)当中RIG-I、MDA-5和IFN-β的水平降低,而IL-10和SOCS3升高。在发生ADE时,IL-10的抑制作用早已被证实,使产生ADE的THP-1细胞分泌低浓度的Ⅰ型干扰素(INF-α/β),从而抑制了IL-12、INF-γ、肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)的转录和翻译,促进了抗炎细胞因子的表达和分泌。Rolph等在使用原始人单核细胞源性的巨噬细胞进行研究时得到了不同的结果,发现当细胞被感染产生ADE时,IFN-β水平降低,SOCS3上调,而IL-10、细胞因子信号抑制因子1(Suppressorofcytokinesignaling1,SOCS1)、RIG-I、MDA-5的表达没有任何变化,同时IL-6显著升高。而IL-6信号与SOCS3的激活有关,这为DENV感染后发生ADE提供了另一种可能的机制,即被DENV感染产生ADE的巨噬细胞中IL-6通过SOCS3抑制抗病毒反应。两次实验中均发现Ⅰ型干扰素(INF-α/β)浓度降低,抑制了IL-12、INF-γ,TNF的转录和翻译,同时促进了抗炎细胞因子的表达和分泌。此外,当细胞感染DENV产生ADE后,可通过破坏一氧化氮合酶基因转录因子的转录,阻断转录信号传导子与激活子1(Signaltransducersandactivationoftranscription1,STAT-1)抑制固有的抗DENV介质/一氧化氮自由基。二次感染DENV发生ADE作用时,体内不仅有白介素浓度的变化,INF及INF诱导产生的细胞因子水平也会发生相应的变化。发生DHF后存活的患者体内血液中INF-β浓度比死亡患者高。对小鼠模型和登革热患者的研究均发现,在症状轻微时,体内大量的INF及INF诱导产生的因子在控制DENV感染时起到了保护作用。登革热患者体内PBMCs中γ-干扰素诱导蛋白10(Interferongamma-inducedprotein10,IP-10/CXCL10)明显升高,在一个小鼠模型中,IP-10作为自然杀伤细胞和T细胞的化学引物,阻断DENV与其受体的相互作用保护机体。分析感染DENV患者的血清时发现单核细胞趋化蛋白2(Monocytechemotacticprotein2,MCP-2/CCL8)在感染发热期和发热后期均显著升高。最近研究发现,DENV二次感染发生ADE效应还与TOLL样受体有关。DENV感染恒河猴后,联合刺激TOLL样受体3(Toll-LikeReceptor3,TLR3)与TLR7/8可以减少病毒复制,并且增强体内的抗病毒免疫反应。同时还发现DENV可以抵消TLR激动剂激活骨髓树突状细胞(Myeloiddendriticcells,mDC)活化和产生IP-10的作用。因此,ADE不仅促进病毒进入细胞,而且增强病毒细胞内复制,调节固有和可调节性细胞内抗病毒机制。3ade效应在临床上的应用研究ADE效应存在于多种病毒的感染过