植物钙信号系统的机制

植物钙信号系统的机制

钙不仅是植物生长发育所必需的大量养分，也是影响多个生理过程的内源性和外源性信号分子。钙对植物细胞的结构和生理功能有重要作用,能维持细胞壁、细胞膜及膜结合蛋白的稳定性,参与胞内稳态和生长发育的调节过程,在细胞内起第二信使作用。钙作为植物细胞的第二信使,对环境信号和内源激素信号等许多刺激有灵敏反应,触摸、病原物侵染、植物激素、逆境(包括盐胁迫、氧化胁迫、低温、高温和干旱等),均能引起胞内Ca2+水平改变。Ca2+参与的信号转导过程一方面依靠浓度的振荡传递信号,另一方面依靠其下游功能蛋白(如蛋白激酶/蛋白磷酸酶级联系统)放大信号。近年来,通过对拟南芥叶片保卫细胞进行研究,Han等在细胞表面发现钙敏感受体(Ca2+sensingreceptor,CAS),并证实胞外Ca2+作为胞外信使可将胞外Ca2+变化与胞内Ca2+特异性变化联系起来,确定了Ca2+在植物中第一信使的位置。郑海雷等在此研究基础上发现并确定了拟南芥胞质钙离子周期性振荡与钙受体-三磷酸肌醇途径相偶联。从而进一步证实了胞外Ca2+作为第一信使的作用,这对钙信号系统特别是钙信号的产生过程做出了有力补充。作者对钙信号系统的最新研究进展进行了综述,以期对同类研究提供借鉴参考。1ca2+浓度变化的细胞外质界表1在植物体中,细胞必须对一系列环境及生长因素做出回应。而在植物进化的过程中就产生了能够做出适当回应的形式多样的信号网络系统,包括一系列受体,非蛋白信使,酶系统及转录因子。受体对特定生理刺激高度敏感,并且能将其区分识别。同样的酶系统和转录因子也具有特异性,这反映在丰富基因组水平上。细胞质中的自由Ca2+浓度变化显然就是对外质界生理及非生理信号的一个反应。即Ca2+通过Ca2+通道内流进入胞质,并通过Ca2+-ATPase和Ca2+/H+反向转运蛋白外流以保持胞质内低Ca2+浓度。为了应对植物发育和环境胁迫信号,Ca2+由质膜、液泡膜和内质网膜的Ca2+通道内流进入胞质,导致胞质Ca2+浓度迅速增加,产生钙瞬变和钙振荡,传递到钙信号靶蛋白,如钙调素、钙依赖型蛋白激酶及钙调磷酸酶B类蛋白,引起特异的生理生化反应。1.1ca2+转运系统细胞质中浓度过高的游离Ca2+可与磷酸盐形成沉淀,干扰与磷代谢有关的过程,妨碍正常的信号转导,对植物生长不利。因此,植物细胞内存在精细的调节机制,既能使细胞质中游离Ca2+浓度迅速升高以响应环境变化,又能使其维持基态条件下的低浓度,这些精细的调节机制主要通过体内的Ca2+转运系统来实现,包括胞质Ca2+外流系统,即Ca2+-ATPase和Ca2+/H+反向转运蛋白,以及Ca2+进入胞质的内流系统,即钙离子通道(图1)。这些通道使钙离子由高电势处(从细胞外或从细胞内钙库)流向低电势处,而调节通道的开关由各种刺激因素决定,钙信号就是通过离子通道开关来产生(图2)。1.1.1ca2+-atpase的动态胞质Ca2+外流系统主要是Ca2+-ATPase和Ca2+/H+反向转运蛋白。Ca2+-ATPase也称Ca2+泵(calciumpump),几乎存在于植物细胞中所有的膜系统上,包括质膜、液泡膜、内质网膜、线粒体膜、质体和叶绿体膜以及核膜等,其分布与植物的种类和组织特异性有关。Ca2+-ATPase对Ca2+有较高的亲合性(Km=0.2～1.0μmol/L),但运输能力低。Ca2+-ATPase存在两种构像状态,E1态(对Ca2+亲和性高)和E2态(对Ca2+亲和性低)。E1和E2通过与Ca2+的结合与释放,进行不同的反应,伴随天冬氨酸的磷酸化而将ATP的能量贮存入蛋白质中,并在以后的水解过程中将能量释放出来。细胞质内Ca2+浓度的微弱变化能够激活Ca2+-ATPase,其通过水解ATP提供能量把Ca2+主动从胞质运输到胞外或细胞器中。因此,在调节胞内Ca2+稳态时起到一种灵敏的微调作用。Ca2+/H+反向转运蛋白依赖H+-ATPase或H+-PPase产生的跨膜质子梯度来驱动Ca2+的运输,属于次级主动运输(secondaryactivetransport)。与Ca2+-ATPase相反,Ca2+/H+反向转运蛋白是低亲合(Km=10μmol/L),但运输能力强的载体,在胞质Ca2+浓度水平很高时发挥作用。1.1.2质膜的特殊功能到2000年止,在植物细胞质膜上主要有2种钙离子通道:一类是电压依赖型(voltagedependent)钙离子通道,可分为去极化钙离子通道(depolarization-activatedcationchannel,DACC)和超极化钙离子通道(hyperpolarization-activatedcationchannel,HACC)。一般来说,高等植物细胞质膜内外存在-120～-180mV的电势差(外正内负)。许多生理性刺激因素,如结瘤因子、生长素、脱落酸、光以及植物毒素等都可以使植物细胞质膜电位迅速发生变化,随后胞质Ca2+浓度升高,产生特定反应,这些刺激因素有可能通过质膜上的电压依赖型Ca2+通道完成信号转导。细胞质膜上多数去极化激活的钙离子通道(DACC)在膜电位去极化高于-150～-100mV时被激活,而细胞质膜的去极化通常由阳离子(如钾离子)内流引起。超极化激活的细胞质膜钙通道(HACC)在膜电位水平超极化到低于-150～-100mV时被激活。另一类是牵张激活(stretch-activated)钙离子通道。这类通道受到机械张力的调控,在没有外加张力的情况下,通道不开放。牵张激活通道平均开放时间较短,对离子选择性较严格,电流幅度较低。植物的液泡是细胞内贮量最大的钙离子库,其游离Ca2+水平在1.5～2.3mmol/L,比细胞质中高出约1000个数量级。当受到刺激时液泡膜上的钙离子通道释放钙离子到细胞质中,提高胞质的Ca2+水平。液泡膜上有2类Ca2+通道:一类是电压依赖(voltage-dependent)型,受液泡膜两侧膜电位控制,当液泡内与细胞质之间的膜电势差为正值时,通道被打开;另一类是配位体激活(ligandactivatedcalciumchannel)型,包括受环腺苷二磷酸核糖(cyclicADP-ribose,cADPR)激活的Ca2+通道和受三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate,IP3)激活的Ca2+通道。植物细胞内质网中钙离子浓度约为10mmol/L。穿越内质网膜的钙离子内流和外流之间的动态平衡维持着内质网内外钙离子浓度梯度的相对稳定,同时也刺激Ca2+通道的开放,向胞质中释放Ca2+。1.2ca2+信号转导系统的作用机制植物细胞中许多刺激反应都涉及到钙,各种刺激的强度不同,Ca2+介导的反应的程度也不同,这是植物对环境刺激作出反应的一个特点。对于钙信号作用的方式主要涉及到以下几个方面:振幅、频率、持续时间以及Ca2+与其他细胞成分及信号途径之间的作用。Ca2+信号转导系统的中心环节是胞质中Ca2+浓度的改变,最初反应几乎都是引起胞内Ca2+浓度的升高。刺激引发的Ca2+浓度变化可以是瞬时、持续或呈现周期性,从接受刺激到发生明显钙离子浓度变化所需的时间从几秒到几个小时不等。胞质游离Ca2+浓度的变化方式包括钙瞬变(calciumtransient)和钙振荡(calciumoscillation)。1.2.1外或者细胞内钙库管理不当引起ca2+浓度的变化在外源刺激下,胞外Ca2+通过Ca2+通道的开启进入胞内,同时胞内钙库(如内质网和液泡等)向胞质中释放Ca2+,引起胞质游离Ca2+浓度的迅速升高。或者Ca2+/H+反向转运蛋白和Ca2+-ATPase迅速将Ca2+转运到细胞外或者细胞内钙库中,消除了Ca2+浓度的增长。这种钙信号转导方式通常是短暂存在的,Ca2+浓度先升高后降低,该变化模式称为钙瞬变,是最常见的一种钙信号。对于给定刺激,能引起Ca2+浓度瞬时升高方面有许多例子。如:触摸或冷刺激能引起Ca2+浓度的迅速升高,包括液泡膜和质膜Ca2+的流入。氧化胁迫、激发子、系统素和低渗处理能引起不同持续时间的Ca2+浓度瞬时升高。在烟草的热激反应中,热激诱导的胞质Ca2+水平增加来自于胞外和胞内2个钙库。在低温诱导苜蓿的冷驯化过程中,胞质Ca2+水平的增加来自于胞外钙库;触摸和大风均能使Ca2+从胞内钙库释放出来。烟草中,低渗处理导致的Ca2+浓度瞬时升高表明其包括两个过程,先是较慢的幅度较小的Ca2+浓度升高,紧接着是快的大幅度Ca2+浓度升高。1.2.2叶片表皮抗氧化酶系统的调控几种植物细胞类型对一系列生理及非生理刺激的反应是胞质Ca2+浓度的重复升高,称为钙振荡或钙波。根毛Ca2+浓度的重复升高是对结瘤因子的一种应答反应。在厌氧条件下,拟南芥根在重复的Ca2+峰之后表现出厌氧基因的表达。集中于花粉管尖端的Ca2+浓度梯度存在的振荡与花粉管生长速率密切相关。人们认为,不同Ca2+振荡(频率、幅度)模式或产生具体结果的机制包括Ca2+依赖型磷酸酶的活动及不依赖Ca2+的蛋白激酶的活动。Ca2+振荡的产生是由于当细胞受到某种刺激时,胞质Ca2+浓度升高,使得依赖IP3与Ca2+的Ca2+通道被打开,相临近的通道周围的Ca2+浓度升高,继而这些Ca2+通道被打开。Ca2+振荡的移动实际上是Ca2+释放的移动,而不是Ca2+本身的移动。最近对于钙信号传递的研究有一个突破性的进展,就是在拟南芥叶片保卫细胞表面发现的钙敏感受体(Ca2+sensingreceptor,CAS),并且确定了胞外Ca2+在植物中第一信使的位置。叶片表皮1对保卫细胞形成气孔,水分和气体在这里发生交换。非原生质体中的调控因子通过改变保卫细胞的膨胀压来调节气孔的大小,这些调控因子包括植物激素ABA、CO2,生长素以及胞外Ca2+的升高。而胞内Ca2+是调节气孔开闭信号网络中的一个重要组分。通过对Commelinacommunis离体叶片表皮保卫细胞的研究证实,胞外Ca2+升高引起胞内Ca2+的升高。当胞外Ca2+从0.01mmol/L升高到0.1mmol/L,在几分钟时间就可以引起胞内Ca2+不断上升。在此基础上,又发现拟南芥胞质内Ca2+振荡与胞外Ca2+浓度变化同步,很大程度上是通过CAS介导的CAS-IP3途径进行的。CAS调节三磷酸肌醇(IP3)的含量水平,IP3进一步激活胞内钙库的Ca2+释放。胞质内Ca2+浓度振荡与胞外Ca2+浓度振荡幅度还受土壤中Ca2+含量和蒸腾速率的调控(图3)。注:从木质部体液(红色箭头所示)到保卫细胞(GC),Ca2+的浓度会降低。Ca2+被叶肉细胞(Pm)、香毛簇(T)以及保卫细胞周围的辅助细胞(Sc)所运送。保卫细胞中胞外[Ca2+]低于0.1mmol/L,而木质部体液中可以达到几个mmol/L。新发现的位于细胞表面的CAS受体能够感受胞外Ca2+,CAS激活后,使胞内Ca2+升高,从振幅和频率上与ABA的作用类似。Note:Ca2+deliveredfromthexylemsap(redarrows)undergoesprogressivedilutionfromthexylemsaptotheguardcells(Gc).Ca2+isremovedfromtheapoplastbycellsofthepalisademesophyll(Pm),thetrichomes(T)andthesubsidiarycells(Sc)surroundingeachpairofguardcells.Ca2+intheapoplastaroundtheguardcellsislowerthan0.1mmol/L,comparedwithlevelsofthatseveralmmol/Linthexylemsap.TheapoplasticCa2+issensedbythenovelCASreceptorlocatedatthecellsurface.ActivationofCASgivesrisetocytosolicCa2+oscillationsthataresimilarinmagnitudeandfrequencytothoseobservedinresponsetoABAapplication.图3植物中Ca2+的信号传递(仿ColinBrownlee)Fig.3Ca2+signallinginplants2信号型的免疫活性和酶活性最初对钙信号的感应,是通过一系列不同钙信号元件与钙结合产生。细胞中感受Ca2+信号的元件被称为Ca2+感受器或者Ca2+信号靶蛋白。钙信号靶蛋白的激活或抑制是Ca2+信使产生后信号继续传递的下游事件,其参与特异性钙信号的解码和植物生长发育的调节及对外界各种逆境信号的应答转导过程。钙信号元件主要分为信号传递型和信号应答型两种类型。信号传递型如钙调素,通过Ca2+诱导的构象变化将信息传递给对应的蛋白激酶,并使其产生相应的酶活性或构象产生变化(如,钙调素激活的ACA钙离子泵活性)。这种类型的钙信号元件包括钙调素(calmodulin,CaM)和钙调磷酸酶B类蛋白(calcineurinBlikeprotein,CBL)。与之相对的就是信号应答型,通过Ca2+诱导的构象变化直接使其本身产生相应的酶活性(例如,钙依赖蛋白激酶CDPK分子内活性的产生)。正是这两种不同钙信号的解码方式在植物细胞中的广泛使用,才使得钙信号能通过多种途径产生不同的应答反应。2.1生理生化活性钙调素是植物细胞内最重要的Ca2+结合蛋白,是一种单链可溶性球蛋白,分子量为16.7kDa,由148个氨基酸组成,其中1/3的氨基酸残基是带有酸性侧链的谷氨酸和天冬氨酸,不含半胱氨酸和脯氨酸。该蛋白等电点为4.0。热稳定性好,保守性强。其带负电荷的羧基部位与Ca2+相结合,结合后分子构像发生改变,疏水区域呈激活态,从而增加催化活性。钙调蛋白本身没有活性,只有当其与钙离子结合后,引起蛋白构像的改变,使之与其他蛋白酶,如激酶或磷酸酶结合,调节细胞内信号转导。CaM主要通过与CaM结合蛋白(CaMbindingprotein,CaMBP)的结合来介导信号传递,从而调节细胞内的生理生化反应。CaM介导的Ca2+信号转导,是在CaM与其目的蛋白相互作用中对Ca2+依赖性的不同使得细胞对其胞质中Ca2+的升高作出各种复杂的生理反应。热激和Ca2+处理都可增加细胞的钙调素含量,Ca2+-CaM参与了玉米幼苗热激诱导的耐热性发育的调控,其中,SOD作为一种钙调素结合蛋白最终通过增强植物的抗氧化能力提高植物的耐热性。目前,对CaM生理功能的研究涉及面相当广泛,在离子转运、酶活性调节、细胞分裂与分化、细胞骨架与细胞运动、光合作用、孢子种子和花粉萌发、激素反应、胞内酶类及基因表达等生理过程中,都有CaM的参与。2.2与下游蛋白cipk和bol糖质膜的相互作用钙调磷酸酶B类蛋白(CBL)是植物中与动物钙调磷酸酶调控B区同源的一类特殊钙离子受体家族,是最早在动物和酵母中发现的钙离子信号效应器。在拟南芥、蚕豆和烟草等植物体内已发现的钙调磷酸酶为Ca2+/CaM依赖性的异源二聚体蛋白磷酸酶。每个CBL通常拥有4个EF结构域,具有钙离子结合能力,缺乏其他功能区域,只能通过与下游蛋白CIPK(CBLinteractingproteinkinase,与CBL作用的蛋白激酶)的相互作用才能将信号向下游传递。保卫细胞的内向K+流在气孔关闭过程中受到调控,其活性受到钙调磷酸酶B类蛋白的抑制,但是被能逆转钙调磷酸酶作用的免疫抑制剂所活化。研究发现,拟南芥的SOS3(AtCBL4)与酵母钙调磷酸酶的B亚基(Bsubunitofcalcineurin,CNB)和动物神经钙传感器(neuronalcalciumsensors,NCS)相似,都具有豆蔻酰化的明显特征。SOS3感受盐胁迫激发的钙信号(胞内Ca2+浓度增加),特异性地与SOS2的C末端自我抑制区结合,对质膜上的Na+/H+反向转运蛋白SOS1进行调控,实现细胞内外K+和Na+的稳态调节,增强植物的抗盐性。CBL参与植物对干旱和低温的适应性调节,CBL1基因的缺失会大大提高拟南芥对干旱和低温胁迫的敏感性,影响转录因子的表达。2.3cdpk重组酶活性钙依赖蛋白激酶(CDPKs)类蛋白是Ca2+信号转导途径中另一个重要的初级感受器,它是植物中独特的激酶家族,通过其C端与CaM相似的4个与Ca2+结合的EF手型的调控区而鉴定出来。CDPKs含有3个功能区:催化区、自抑制区及Ca2+结合区。其可分为钙依赖蛋白激酶(CDPKs)家族、CDPK关联蛋白激酶(CDPKrelatedproteins,CRKs)家族、钙调素依赖蛋白激酶(CaMdependentproteinkinases,CaMKs)家族、钙和钙调素依赖蛋白激酶家族(Ca2+andCaMdependentproteinkinases,CCaMKs)共4种类型,在结构上具有典型的Ser/Thr蛋白激酶保守序列。当CDPKs与钙离子结合后,它才能表现出活性,进而通过磷酸化作用将信号向下游传递。纯化的CDPKs在mmol/L级Mg2+存在下,受mol/L级Ca2+的激活而使活性提高50～100倍,2mol/LCa2+可使酶活性达到最高值的1/2。当CDPKs被钙信号激活时,其连接区与C末端CaM样结构域之间的相互作用非常重要,它们可能通过形成分子内复合物来解除连接区对催化区的抑制作用,从而激活CDPKs的酶活性。CDPKs涉及多种生理功能,包括参与调节渗透胁迫、干旱、低温、病害和离子运输等过程。3钙信号系统对特定刺激的识别3.1ca2+信号产生的特殊的应激反应不同刺激信号通过不同的应答机制产生特定的应答反应。问题是在单细胞水平上,一个简单的Ca2+信号如何能通过不同的刺激产生并传达相应的信息,从而产生特定的应答反应。例如,生长素和ABA都能够导致气孔保卫细胞内的Ca2+升高,但是生长素导致气孔开放,ABA导致气孔关闭。还有当拟南芥在生长发育中经历了干旱或低温胁迫时Ca2+信号的产生所需要的Ca2+来源不同。但在植物中也存在不同的刺激信号产生相同的Ca2+信号并产生相同的应答反应。最好的例子还是在气孔关闭中,如在光照、CO2及干旱条件下植物气孔的关闭过程中,Ca2+信号就起到了关键作用。3.2胞质ca2+和aba信号尽管多种环境刺激均可引起胞质Ca2+增加,但不同刺激引发的钙信号,在变化幅度、动力学及空间分布方面有所不同,即钙信号存在时空(spatio-temporal)特异性,称为Ca2+记号(Ca2+signature)。如低温引起的胞质Ca2+增加幅度较大,十分短暂,仅持续几秒到几十秒,为尖钉(sharpspike)型。氧化胁迫、盐胁迫所引起的钙信号中Ca2+增加幅度相对较小,持续几分钟到几十分钟,低氧胁迫引起的钙信号可持续几个小时。ABA则可诱导保卫细胞中产生振荡性(oscillatory)钙信号。此外,Ca2+记号还与胁迫刺激本身有关。如在低温下拟南芥产生的钙信号因降温速率的不同而不同,降温速率越快钙信号也越强,其峰也越高越尖;如果降温速率相同而绝对温度越低(在植物忍受范围内)钙信号也越强,并且降温速率和绝对温度相同的重复性低温刺激会减弱钙信号。不同胁迫刺激所引发的特异性钙信号应是植物体感受和传递不同信号刺激的一种机制,从而可以相应引起不同生理反应,以应答不同的外界刺激。3.3渗透胁迫对钙信号的影响此外,钙信号还存在休复期(refractoryperiod),即一种刺激引发植物细胞产生钙信号后在一定时间内同种刺激不能或不能充分再次引发钙信号。但在休复期内非同种的其他刺激却可以再次引发钙信号,表明植物细胞能够区分不同的环境刺激。钙信号存在休复期的作用尚不清楚,但由于胞质内持续高Ca2+可干扰胞内以磷酸为基础的能量代谢而对细胞产生毒害,存在休复期可防止在同种刺激下引起过度延长的高胞质Ca2+而防止细胞受到伤害。Knight等发现,拟南芥经低温预处理适应后再经受低温胁迫时,钙信号的特征会发生改变;经氧化胁迫预处理后再经渗透胁迫处理钙信号强度会下降,而渗透胁迫预处理后再经渗透胁迫处理钙信号强度会增强。Knight等还认为,胁迫预处理对钙信号的修饰可为拟南芥适应逆境胁迫提供记忆(memory),从而改变植物对逆境胁迫刺激的感受状态,增强植物对逆境胁迫的适应性。钙信号在时空特征上的多样性是植物体感受和传导多种环境刺激,引发不同生理反应的基础。4ca2+的成像技术Ca2+是一种最简单的信使,因为其不需要化学合成和修饰,并且是最为通用的信使,在胞内胞外的许多位点发挥着功效。生物信号系统至少由3个基本元素组成:信号、受体以及连接信号和受体之间的途径。简单地说,植物中Ca2+的调节由许多时间和空间上具有一定次序的Ca2+调节单元组成,其中,质膜Ca2+内流通道和内质网、液泡及线粒体Ca2+释放通道提供了多种方式,建立Ca2+梯度,并使胞质Ca2+浓度迅速增加。一旦胞质Ca2+浓度增加,植物中大量的Ca2+感受器,如CaM、CDPK以及CBL与Ca2+相结合,通过磷酸化过程,刺激或抑制某一生化反应,最后经过放大调节,植物表现出独特的周期性Ca2+信号应答机制。对拟南芥的蛋白质组学研究分析表明,其在不同生长时期拥有700多种由Ca2+信号调控的蛋白单元,而正是如此丰富的Ca2+信号变化方式保证植物将刺激转化为正确的应答反应。电生理学家研究怎样通过Ca2+通道作用增加胞质Ca2+浓度,启动Ca2+信号,而生化学家则研究如何通过Ca2+/H+