ph的ph值法测定葡萄糖中微量葡萄糖

ph的ph值法测定葡萄糖中微量葡萄糖

葡萄糖的测定已经报告。虽然检测方法不同，但大多数方法都采用了相同的反应机制。葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化分解为葡萄糖酸，并释放二氧化水。然后通过降低或增加呼吸浓度来间接测定葡萄糖。这种方法通常具有很高的选择性，但葡萄糖的固定化或电磁化过程复杂，酶柱或电磁化使用寿命短，成本高等。本实验采用了葡萄糖做还原剂,先将银离子还原为银,银再将三价铁离子还原为二价铁离子,以邻菲罗啉络合显色,用分光光度法测定。该方法简单、易行且灵敏度较高。1实验部分1.1酸度计和溶剂722型可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂),PHS-3C型酸度计(上海大普仪器有限公司)。葡萄糖标准溶液:0.0011mol/L;硝酸银溶液:0.01mol/L;氢氧化钠溶液:0.1mol/L;硫酸铁铵溶液(0.1mol/L的硫酸为介质):0.004mol/L;不同pH值和pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液;0.1%的邻菲罗啉溶液。所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水。1.2硫酸铁铵盐碱连环剂为单一溶剂移取一定量的葡萄糖标准溶液于25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸银溶液,0.75mL的氢氧化钠溶液,摇匀,沸水浴中加热10min后,冷却至室温;依次加入0.75mL硫酸铁铵溶液,2.5mL缓冲溶液,1.5mL邻菲罗啉溶液,再在沸水浴中加热20min,冷却至室温,以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。用1cm比色皿于510nm波长处,以试剂空白为参比,测其吸光度。2结果与讨论2.1绘制吸收曲线按实验方法测定标准溶液在不同波长下的吸光度,绘制吸收曲线如图1所示,结果发现在λ=510nm处,络合物[Fe(o_phen)3]2+具有最大的吸光度,因此选用510nm为测定波长。2.2加热方式的确定葡萄糖与氧化银的反应在室温下可以进行,但重现性差,即使延长反应时间,结果仍不稳定。本文采用加热的方式提高反应速度,通过对不同温度和不同时间的多次比较,发现前三种溶液加完后,在65℃以上水浴加热10min,等加完全部溶液后,再在同温下加热20min,吸光度达到最大值且稳定,考虑到加热的便利性,选在沸水浴中加热。2.3加入硝酸银、邻菲罗啉、硫酸铁铵等聚合物液硝酸银溶液的用量太少,难以生成沉淀,反应不完全;用量太多,后续步骤中的沉淀不能溶解完全,出现轻浑浊现象影响测定。我们对硝酸银做了以下研究,分别移取1mL葡萄糖标准溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入不同量的硝酸银溶液,再加入0.75mL氢氧化钠溶液,摇匀,在沸水浴中加热10min,冷却至室温;依次加入0.75mL硫酸铁铵溶液、2.5mL缓冲溶液、1.5mL邻菲罗啉溶液,再在沸水浴中加热10min,冷却至室温。以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以试剂空白为参比,由实验可以得出,在加入的1.0mL1.25mL硝酸银溶液的容量瓶中,后续沉淀多且不稳定,因此不适合。而硝酸银溶液的用量选择0.25mL、0.5mL、0.75mL时,几乎没有后续沉淀且稳定,0.5mL时的吸光度最大,因此,综上所述,硝酸银溶液的用量应选择0.5mL比较合适。2.4液的用量的确定氢氧化钠溶液的用量少,不利于葡萄糖与氧化银反应;用量太大,后续步骤中将会出现氢氧化铁沉淀,影响实验的测定。基于此,我们对氢氧化钠溶液的用量进行了以下实验:分别移取1mL葡萄糖标准溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸银溶液,再加入不同量的氢氧化钠溶液,摇匀,在沸水浴中加热10min,冷却至室温;依次加入0.75mL硫酸铁铵溶液,2.5mL缓冲溶液,1.5mL邻菲罗啉溶液,再在沸水浴中加热10min,冷却至室温。以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以试剂空白为参比,由实验得知,氢氧化钠溶液的用量选择0.50mL为宜。2.5铁铵溶液的配制由于硫酸铁铵溶液配制时加有硫酸,起到防止铁水解和溶解未反应的氧化银的作用,用量少氧化银不能溶解;用量过多又影响吸光度的测定。基于此,对不同用量的硫酸铁铵溶液进行了测定。分别移取1mL葡萄糖标准溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸银溶液,再加入0.50mL氢氧化钠溶液,摇匀,在沸水浴中加热10min,冷却至室温;依次加入不同量的硫酸铁铵溶液,2.5mL缓冲溶液,1.5mL邻菲罗啉溶液,再在沸水浴中加热10min,冷却至室温。以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以试剂空白为参比,由实验得知,在0.75mL硫酸铁铵溶液用量合适并且具有最大的吸光度,所以选择0.75mL硫酸铁铵溶液用量。2.6铁离子的还原实验表明,当被测定液pH值在4~9范围,测定的结果较为准确,溶液酸度过高,不利于三价铁离子的还原;酸度过低,会使铁离子沉淀,同时造成邻菲罗啉合铁(Ⅱ)络合物分解,影响显色的灵敏度,造成测定的结果偏低。我们对不同酸度的溶液的吸光度进行了多次研究,最终选用pH=4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液控制被测液的酸度。2.7邻菲罗啉吸收剂用量的确定邻菲罗啉溶液起到显色的作用,我们用上述的方法对它进行了研究:分别移取1mL葡萄糖标准溶液于10只25mL容量瓶中,依次加入0.5mL硝酸银溶液,再加入0.5mL氢氧化钠溶液,摇匀,在沸水浴中加热10min,冷却至室温,依次加入0.75mL硫酸铁铵溶液,2.5mL缓冲溶液,不同量的邻菲罗啉溶液,再在沸水浴中加热1min,冷却至室温。以蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以试剂空白为参比,测其吸光度。结果可知,邻菲罗啉溶液的用量大于1.5mL时的吸光度最大且稳定,并且大于1.5mL时的吸光度相差不大,故本实验选用1.5mL邻菲罗啉溶液的用量。3样品分析3.1朗伯—工作曲线移取不同量的葡萄糖标准溶液于数只容量瓶中,按实验方法进行显色,绘制工作曲线如图2所示,由图2可知,葡萄糖的含量在0~88μg范围内符合朗伯—比尔定律,直线回归方程为A=0.00813C+0.2026,r=0.9989。3.2邻菲罗啉总总反应时间的测定准确移取葡萄糖注射液1.00mL于500mL容量瓶中,用蒸馏水释至刻度线,摇匀,从中取0.5mL置于25mL容量