生物技术前沿动态-肖璐-4

生物技术研究前沿动态湖南科技大学生命科学学院生物技术系肖璐一什么是生物技术Coinedin1917byKarlEreky,anHungarianengineerDefinedas:Allthelinesofworkbywhichproductsareproducedfromrawmaterialswiththeaidoflivingorganisms.生物技术：1917年匈牙利人KarlEreky提出，其含义为“用甜菜作为饲料进行大规模养猪时，即利用生物将原材料转变为产品”。生物技术（biotechnology），有时也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术是人们利用微生物、动植物体对物质原料进行加工，以提供产品来为社会服务的技术。二生物技术的重要性

有助于解决全球的重大难题：资源（能源）、人口、粮食、生态环境、健康与疾病和战争与灾害；促进传统产业的技术改造和新产业的形成，对人类社会生活产生深远的革命性影响；生物技术这一新生事物正迅速走向老百性日常生活各个方面,将对人类的发展做出巨大的贡献。三我国生物技术产业发展现状

发展生物经济正在成为许多国家应对金融危机的战略措施。生物技术是我国需求最迫切、技术与国外差距较小的领域之一，我国将把生物技术作为当前科技发展的重点，把生物产业作为新兴产业培育的重点，把生物经济作为引领新经济发展的重点。2008年全国生物技术产业总产值突破8000亿元，同比增长26%。生物技术的工厂数量不断增加。目前在中国约有500多家民营的生物技术公司，其中在生物医药技术领域约有300多家企业。经过20多年的发展，中国的生物技术与产业已经开始了从跟踪仿制到自主创新的转变，从实验室探索到产业化的转变，从单项技术突破到整体协调发展的转变。为促进生物产业加快发展，中央财政2009年安排328亿元，2010年安排300亿元左右，同时带动企业投资到11个科技重大专项，其中包括转基因生物新品种培育、重大新药创制、艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治等。根据《生物产业发展“十一五”规划》，到2010年，生物医药产业增加值将达到5000亿元以上。在此基础上，到2020年全国生物产业增加值将突破2万亿元，成为高技术领域的支柱产业和国民经济的主导产业。预计到到2015年，中国生物产业的产值规模将超过3万亿，到2020年会达到6万亿左右，我国力争到2020年，实现生物技术的跨越发展，使生物技术研发水平跃居世界先进行列。加速科技成果产业化，培育生物新产业，形成2-3万亿元的产值，力争使我国成为生物技术强国和生物产业大国。为实现这一目标，我国将实行“三步走”战略：第一步，技术积累阶段，到2010年左右，形成5000-8000亿元规模的生物技术产业；第二步，产业崛起阶段，到2015年左右，生物产业总产值力争达到16000亿元；第三步，持续发展阶段，到2020年左右，生物产业总产值达到2-3万亿元，形成国民经济新的支柱产业。美国商业评估公司预计2020年生物技术产业将成为第一大产业，生物技术的发展潜力巨大。四生物技术发展的基础基因工程发展的取决于三大理论和技术的建立理论基础:40年代，遗传信息的携带者是DNA；50年代，DNA双螺旋模型和半保留复制机制；50年代末到60年代，中心法则、操纵子学说、遗传密码技术基础：实验技术的三大发现：DNA分子的体外切割与连接技术的发现；质粒与克隆载体的发现；逆转录酶及反转录技术的发现。1973年，斯坦福大学StanleyCohen和HerbertBoyer，第一次成功地进行了基因克隆实验，从此拉开了基因工程发展的序幕。五基因组研究计划

为什麽中国要加入人类基因组计划

1)人类基因组计划需要中国（家系纯基因资源丰富）

2)抢占科技平台，平分天下秋色。

3)技术力量厚，有研究基础

4)拥握科技、军事杀手剑

5)重大事件的刺激

1999年以前中国对虾患病毒病，大量死亡，为对付此种病毒要进行测序，由于国内作不了，180万美金委托国外做，又转让1/3知识产权。

2003年在SARS面前中国科学家整体打了败仗，非典出现在中国，中国最早拿到病毒样品，但病毒序列却被外国人首先测序破译六、人类基因组计划的意义

1、是人类的第二张解剖图，在分子水平揭示人类的生、老、病、死之迷

2、比较基因组结构，阐明生物的进化关系，揭示当代科学的第六大悬案—人类进化的缺环。

悬案1、宇宙生命何处觅

悬案2、黑洞天体为何物

悬案3、引力辐射问题

悬案4、太阳系的第十个行星

悬案5、新元素的发现。现有109号元素，但新修的元素周期表可容纳164号元素

悬案6、人类进化有缺环，即人类与猿之间的亲缘关系似乎还有一个中间过渡的生物类型，但至今没发现化石

3、遗传与优生依据

4、建立个体医学的指南，绘制21世纪基因医学蓝图

5、准确进行基因的分离和克隆

6、研制基因组药物活字典，基因治疗

7、延长人的寿命（180—1200岁）

8、建立基因组身份证，精确进行DNA亲子鉴定,建立洁净法庭

9、进行电子杂交，加快研究进程

10、标记辅助选择。把目的基因开发成分子标记，根据图谱间接选择目的基因，减少育种盲目性，缩短育种年限

七、人类基因组计划的潜在危险

1、基因武器

给种族基因武器奠定理论基础。不同种族的基因组都有脆弱点，对某种病或某种细菌药物敏感。针对其脆弱点可设计基因武器目前美、俄、英、德等有15个国家有基因武器

1976年，前苏联提出以特定种族为对象就研制种族基因武器阿拉伯种族的基因组对爱滋病的HIV的敏感性强，以色列研制了专门针对阿拉伯人的基因人种炸弹英国研制成了转基因超级病毒—基因杀人虫

非洲、中东人群的基因组对裂各热细菌敏感，美国马力兰州军事医学研究所是基因武器研制中心，在普通酿酒菌中接入一种专能在非洲、中东引起可怕的裂各热细菌的基因以把裂各热细菌的基因转入了酿酒菌种，专门对付中东人美国研制成的热毒素基因毒剂，20克可毁灭全人类

SARS病毒测序结果证明基因组40%被人工修饰

5000万美金建造的基因武器库相当于50亿美金建造的核武器库，

2、基因歧视

种族之间不存在优秀基因组，但是，不同的家族之间确实存在不同的致病基因，不同的家族含致病基因的数量不同。

3、基因掠夺

人类基因资源有限，仅仅3.0—3.5万，美国派中国留学生回国采血样，到一些不发达国家采血样。毛利人抗议：你们过去抢走了我们的黄金、我们的砖石，现在又要来抢我们的基因了。

4、基因专利

主流科学家和美国国立公司的观点：为了不让想获得专利的人得逞，美国立公司有了新

新成果马上网上公布。沃森强调：人类基因组属于全人类，而非任何个别国家。

Cerala公司的观点：认为公司投资大，理应有回报，利于该项事业发展，认为发现基因组中的某个基因属于科学发现，不应授予专利，但搞清楚了某基因的位置、功能、结构，此属于科学发明，应该授予专利。

克林顿总统、布莱尔总统共同发表声明：

人类基因组图谱应成为社会公有资源，无偿提供给所有研究者使用。但声明发表后引起生物技术公司股票大跌，为此，白宫紧急澄清：不反对企业为单个基因的功能研究的成果申请专利。

美国人类基因科学公司已克隆人类基因8000多个因塞特公司已克隆7000多个，中国也已克隆

10000多个，仅次于美国。中国联合基因科技集团已申请专利3500个。位居世界第三。5、基因伦理

社会心理的改变：可能被别有用心的人利用，诱使走向基因还原论、基因本质论、基因决定论，步优生学的后尘隐私权：婚姻权：生育权：就业权：求学权：生存权：

就医权：八基因组学的发展历程流感嗜血杆菌(haemophilus

influenzae)

1995年7月第一个细菌基因组全序列发表,大小为1.8Mb。含1703个基因或开放阅读。这是微生物乃至整个生物学领域的一个里程碑.(Science)1997年9月,大肠杆菌的完整基因图谱已绘制成功,基因组全序列完成,全长为5Mb,共有4288个基因,同时也搞清了所有基因产物的氨基酸序列.啤酒酵母，1997年，第一个真核生物基因组图谱公布。秀丽线虫(caenorhabditis

elegans)

1998年12月完成了基因组测序。基因组大小100Mb,分布于6条染色体,预测有19，099个基因。果蝇Celera公司2000年3月宣布了基因组全序列为180Mb。有13601个基因,其中一半的基因功能还没有搞清楚,有1600个碱基跨度区仍未能完全测序。2000年12月,第一个植物基因组——拟南芥基因组被全部测序,遗传图谱、物理图谱建立,序列大小为125Mb。基因组测序区段覆盖了全基因组的115.4Mb,分析共含有25498个基因,编码蛋白来自11000个家族。2001年2月中旬，《Nature》与《Science》分别发表了人类基因组工作框架图,报告人类基因组共有30亿个碱基对,预测编码基因31000个,比最初预测的10万个编码基因数大大减少。2002年4月，水稻基因组图谱公布。2002年

小鼠、疟原虫和按蚊基因组测序完成鼠基因组共有约27亿个碱基对，比人类少15％，但其包含的基因数目约在3万个左右，与对人类基因数的最新估计非常接近。疟原虫的裂殖子疟原虫破坏两个红细胞人被蚊子咬之后5到10分钟，疟原虫孢子就会到达肝脏，入侵肝细胞，在这里它们可以躲过人体免疫系统的攻击。孢子侵吞肝细胞的营养，大量地分裂繁殖，大概一个星期之后胀破肝细胞跑出来，将数以百万计的新孢子释放进入血液。新的孢子马上入侵红细胞，再次逃过免疫系统的追杀。它们以血红蛋白为食，继续繁殖，大概两天后破坏红细胞，产生更多的孢子入侵其它红细胞……用不了多久，2/3的红细胞都会被疟原虫占领。疟原虫在血液里这种周期性的繁殖过程，就会导致病人三天两头地发高烧、打寒战。人肝细胞内间日疟原虫（Plasmodiumvivax）细胞前期成熟裂殖体疟原虫是疟疾的病原体，分布区几乎遍及全球。间日疟原虫是四种寄生于人体的疟原虫之一。2003年

人类基因组计划宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现人类遗传变异图谱研究以及黑猩猩基因组测序计划开始2003年11月，世界上首个复杂生物体的蛋白图谱－－果蝇蛋白图谱公布，从而实现了只显示遗传密码的基因图谱到揭示遗传密码功能的蛋白图谱的飞跃。这个果蝇（Drosophilamelanogaster）蛋白图谱发表在《科学》杂志的网络版上这篇研究发布的这个含有7,000多个果蝇蛋白的图谱含盖了这些蛋白之间超过20,000种不同的互作。这些果蝇蛋白有许多与人类蛋白类似，适于作为研制小分子药物如用于治疗癌症、心脏病和糖尿病的口服药片等的靶点2004年３月１日多国科学家组成的两个研究小组宣布绘制出鸡的基因序列草图和遗传差异图谱。

科学家选取了家鸡的远祖——红原鸡为测绘对象，绘制出了草图中约10亿个碱基对，相当于人类的三分之一。科学家在９日出版的《Nature》杂志上载文说，分析发现，红原鸡约有２万到2.3万个遗传基因，与人类数量基本持平，其中有60％与人类相同。鸡基因组的分析还仅仅是开始，不过已经得出了一些出人意料的结果。科学家们发现，控制鸡生成角蛋白的基因与预想的不同。角蛋白构成人类的头发、指甲，以及鸟类的喙和羽毛，科学家一直认为哺乳动物和鸟类的角蛋白来源相同。但图谱显示，鸡的角蛋白基因与哺乳动物的区别很大。科学家由此推测，角蛋白可能独立进化出了两次。九意外的发现另外，此前科学界一致认为鸡没有嗅觉，但是分析结果表明鸡具有大量的嗅觉基因，味觉基因却很缺乏。分析还发现，鸡缺乏人类所具有的产生乳汁、唾液和牙齿的基因。意外的发现十鸡基因组研究的意义鸡是研究低等脊椎动物和人类等哺乳动物的一种比较理想的中介。将人类基因组与鸡等其他生物的基因组进行比较，有助于更深入理解人类基因的结构和功能，进而开发治疗疾病的新手段，对于培育优质鸡种、改善食品安全、控制禽流感病毒的蔓延也有重要意义。鸡是种常见的家禽，长期受到进化生物学家的青睐。它的基因序列也有助于科学家了解农业和进化学上重要特性的遗传学基础。十一鸡的进化研究转基因小鸡对鸡和人类的基因组进行比较后发现约七千万个碱基对是共有的。这暗示着在大约三亿一千万年前二个物种从共同祖先分化出来的时候，遗传物质具有守恒性。鸡和所有的哺乳动物多起源于恐龙“分道扬镳”在鸟类和哺乳动物分离的时候，鸡获得了生成羽毛和喙的蛋白质的基因，而哺乳动物获得了毛皮蛋白质的基因，丧失了与蛋清和蛋黄有关的基因。鸡的基因组比哺乳动物的紧凑的多，它拥有2万到2.3万个基因，但仅有十亿个DNA碱基，而同样多的基因人类需要三十亿个碱基。鸡的基因数量与哺乳动物的相当，但它的基因组含有重复的“垃圾”DNA的数量很少。我国科学家在鸡基因组学研究上的重大突破中国科学院北京基因组研究所在国际合作的框架下参与和主持完成的原鸡基因组和家鸡基因组多态性研究并于2004年12月9日发表在《自然》杂志上以主题科学论文的形式发表。《Science》发表论文

我国家蚕基因组研究获国际认可2004年12月10日西南农业大学家蚕基因组研究群体的研究论文《家蚕基因组框架图》，于12月10日在国际顶尖科研杂志《Science》上发表，这标志着重庆市家蚕基因组研究成果已得到国际学术界的认可。丝腺是合成茧丝蛋白质的生物器官，是蚕丝产业的生物学基础。科学家通过分析家蚕基因组和基因表达谱，发现了1874个家蚕丝腺特异基因，其中97％为新发现；发现了丝腺中激素活动的证据；科学家甚至比较了家蚕与被称为“生物钢”的蜘蛛丝的生产者——蜘蛛的基因构成，发现了它们共同拥有的１０７个基因。这些功能基因的获得和功能分析的深入开展，将彻底突破茧丝蛋白质合成相关基因克隆和研究的瓶颈。而随着家蚕丝腺特异基因研究的深入，中国将很快在改造丝蛋白质结构，克服丝绸天然加工弱点等重要产业技术的研发方面取得突破。十二、结构基因组学（一）概念和目的（二）基因图谱（三）结构基因组学研究常用方法概念和目的以全基因组测序为目标的基因结构研究弄清基因组中全部基因的位置和结构，为基因功能的研究奠定基础。其目的是建立高分辨的遗传图谱、物理图谱、转录图谱和序列图谱。结构基因组学研究常用方法1.脉冲场凝胶电泳（PFGE）2.毛细管电泳3.基因芯片技术4.全基因组随机测序十三、功能基因组学1.概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能。研究角度包括：生物学功能、细胞学功能、发育学功能等。2.功能基因组学常用方法和技术⑴RNA干扰技术（RNAi）⑵蛋白质组学研究⑶生物信息学研究十四、比较基因组学利用人类基因组与模式生物基因组之间编码顺序上组织结构上的同源性，发现和克隆人类和其他物种的基因，提示基因功能，从而阐明物种的进化关系及基因组的内在结构。十五生物技术的应用为解决人类面临的重大问题提供新途径,带来了希望(国外称之为六大危机):

①人口问题:A)节育:药、疫苗,B)优生:遗传病基因治疗。②粮食问题:

绿色革命,高产、优质、抗病新品种,

农药、肥料。③能源、资源问题:生物电池、光合菌、乙醇生产、石油采集菌、生物冶炼。④环境污染:石油、污水,有害金属污染,特嗜菌的构建。⑤医疗保健:抗衰老、防治心血管病、疟疾、传染病、遗传病(见下)。⑥战争等灾害：生物战剂、生物恐怖。（一）

为医药工业带来革命

新药的设计与生产

1.大量生产生化药物

如基因工程生产的生长激素释放抑制激素:9升发酵液可得50mg纯化产品,这和从50万头羊脑组织中的提取物相当。转基因动物生产tPA

一个动物一个工厂,放牧,挤奶,提取便可。目前不包括抗生素在内,研究基因工程药物达500种,如许多活性多肽、激素、酶、细胞因子,尤其是后者目前是热门,研究30种,生产已有19种。2.改造、促进抗生素工业,

除固定化酶、细胞技术,包括对酶的更新。例如:基因工程可生产强有力的新酰化酶,可大量制备新抗生素(如头孢毒素等)。3.“生物导弹”药物:

①McAb—毒素蛋白、抗癌药、TNF、酶等。②Abzyme，特异结合＋酶切分解。③受体药物“爱国者导弹”:CD4受体—HIV等。4.超级药物

人工设计、合成分子药物:①反义核酸、基因封条、阻止转录、翻译,②酶性RNA(Ribozyme)切掉有害基因。5.酶制剂基因工程:

如:tPA(组织纤维蛋白溶酶原激活因子),链激酶等。基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg（二）动物生物技术（Animal

Biotechnology）TransgenicsaregeneticallymodifiedorganismswithDNAfromanothersourceinsertedintotheirgenomeAlargenumberoftransgenicanimalshavebeencreatedMiceCowsPigsSheepGoatsFishFrogsInsectsCurrently,notransgenicanimaloranimalproductisapprovedbytheFDAorUSDAforhumanconsumptionSomeofthegoalsoftransgenicanimalcreationare:ResearchintoanimalandhumandiseaseImprovelivestockanimalsUseofanimalsasbioreactorsTransgenicAnimalCreationMicroinjection

intothegermline->transgenicanimalGeneinjectedintothemalepronucleiEggsareinfectedpriortofertilizationVirusintegratesintooneofthechromosomesRecombinantDefectiveRetrovirusLinkerBasedSperm-MediatedGeneTransfer(LB-SMGT)精子介导的转基因SpermfertilizestheeggcarryingtheforeigngeneintotheeggwhereitisincorporatedintothegenomeSomeofthedrawbacksofthesemethodsare:TheinsertedDNArandomlyintegratesintothegenomeTheeggsmustbeharvested&fertilizedinvitroMorethanonecopyofthegenemaygetintothegenomeTransgenicAnimalGenerationExamplesofTransgenicAnimalsTransgenicCattle转基因牛

Dairycowscarryingextracopiesoftwotypesofcaseingenesproduce13%moremilkproteinNotonlywillthismakethemilkmorenutritious,itwouldallowforlessmilktomakemorecheeseCurrentlythemilkfromtheseanimalsisunderFDAreviewTheimportantdifferencebetweenthis&othertransgenicsisthattheDNAaddedisnotforeignTransgenicFishTilapia（罗非鱼）Salmon/trout(鲑鱼/鳟鱼)Catfish鲶鱼Cangrowupto6timesfasterthanwildtypefishMosthaveextracopiesofgrowthhormone(GH)geneTransgenicWildtype/nbt/journal/v19/n6/images/nbt0601_500a_I1.jpgThetransgeneusedtoincreasegrowthutilizesanantifreezeproteinpromoterconnectedtotheGHcDNA/hotartcl/chemtech/99/jun/fletcher.htmlAswatertemperaturedropstheGHgeneisturnedonThefishcontinuetogrowwhennormallytheywouldnotAntifreezepromoterfrompout/hotartcl/chemtech/99/jun/fletcher.html+AntifreezewildtransgenicAntifreezeProteins(AFP)AFPslowerthefreezingtemperatureofblood&fluidsTroutnormallydonotsurviveinwaterbelow–0.6°CTransgenictroutcontaininganAFPgene&promotercansurviveinwatersascoldas–1.2°CAnimalBioreactors“Pharming”.uk/science/genes/gene_safari/pharm/a_pharming.shtml1997,Tracythesheep,thefirsttransgenicanimaltoproducearecombinantproteindruginhermilkalpha-1-antitrypsin(AAT)treatmentforemphysema(肺气肿)&cysticfibrosis(囊性纤维病)CreatedbyPPLTherapeutics&TheRoslinInstituteWebsterandPeterNexiaBiotechnologiestransferedthesilkgenefromOrbspidersintogoatsTheresultingmalegoatswereusedtosire(种畜)silk-producingfemalegoatsEachgoatproducesseveralgramsofsilkproteininhermilkThesilkisextracted,driedtoawhitepowder,andspunintofibersThefibersarestrongerandmoreflexiblethansteelTransgenicmalekidscarryingsilkgeneGTCBiotherapeutics(生物治疗药物)hasreceivedapprovaltosellhumananti-thrombin(凝血酶)(ATryn)purifiedfromgoat’smilkinEuropeTechnologyisnotrestrictedtocows,goats,&sheepThereisinterestinusingrabbitssincehousingcostsaresignificantlyless&generationtimeisfasterChickenswhichproducerecombinantdrugsintheireggshavebeenproducedbyTheRoslinInstituteOtherTypesofTransgenicAnimalsTransgene->Genecodingforagrowthhormone

ANDi,thefirsttransgenicprimateborninJanuary,2000224unfertilizedrhesus(恒河猴)eggswereinfectedwithaGFPvirus~Halfofthefertilizedeggsgrewanddivided40wereimplantedintotwentysurrogatemothersfivemaleswereborn,twowerestillborn(死产的)ANDiwastheonlylivemonkeycarryingtheGFPgene/unparchive/2001/011001andi.shtmlAlba,theEGFP(enhancedGFP)bunnyCreatedin2000asatransgenicartwork/gfpbunny.html#gfpbunnyanchor/story/_a/glowing-pig-passes-genes-to-piglets/20080109143909990001?ncid=NWS00010000000001TransgenicPigsPassontheTransgeneGloFish,originallydevelopedinSingaporeasawaytomonitorwaterpollutionThenormallyblack-and-silverzebrafishwasturnedgreenorredbyinsertingvariousversionsoftheGFPgeneGlofishareonsalethroughouttheUSexceptinCaliforniaGlofishretailforabout$5perfish.Normalzebrafishcostaroundonetenthoftheprice.sg/corporate/research/gallery/research12.htm转红色珊瑚萤光基因Mouse“Knock-out”TechnologyGeneTargetingKnock-outtechnologyallowsforthespecificlossofageneinmiceAllowsforthefunctionoftheKO’dgenetobededucedfromthedefectsseeninthemicecanbeusedtomimicksomediseaseUnliketraditionaltransgenicsthetrangeneistargetedtoaspecificsiteintheDNAofthemouse/SC_COBRE/CORE-B/Resources-B.htmMouseKnock-outsrequireembryonicstem(ES)cells

Thesearederivedfromtheinnercellmass(ICM)ofablastocyst(theICMiswhatwillbecomethefetus)EScellsarepluripotentmeaningtheycanbecomeallthedifferentcelltypesfoundinanadult.au/blasto.htmlBlastocystInjectionBlastocyst EScellshttp://bunseiserver.pharm.hokudai.ac.jp/gihou/knockout.htmlChimericmouseThebrownfurcomesfromEScellsinjectedintotheblastocystofanalbino(白化体)mouseSomeExamplesofKnockoutMicep27knockoutmouseisbiggerthanthecontrolThisisnotduetoobesity,buttheskeletalstructureisincreasedinsize(everythingaboutthemouseislarger)http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/saibouE.htmlp27knockoutmousehttp://www.bbc.co.uk/science/genes/gene_safari/wild_west/bigger_and_better02.shtmlGDF8(Myostatin)knockoutmouseOvertwicethemusclemassofawildtypemousenormal knockoutNaturallyOccurringGDF8Mutantshttp:///victoriatimescolonist/story.html?id=67f15c17-2717-4022-bb76-1b982456e793&k=94653http://www.bbc.co.uk/science/genes/gene_safari/wild_west/bigger_and_better02.shtmlFGF5knockoutmousehaslong,angora-likehairhttp://www.med.uni-jena.de/ivm/deutsch/method/method_7.htmClonesandCloning/community/health-science/scientificcommunity/index2.htmlDollyasalambwithhersurrogatemotherDolly,FirstMammalClonedFromanAdultCellDolly,asanadult/cloning3.htmSomaticCellNuclearTransferWhatHasBeenClonedSoFar?SomaticCellNuclearTransferSheep,Goat,Mouse,Rabbit,Cattle(domestic&wild),Pig,Horse,Mule,Dog,Cat(domestic&wild),DeerEmbryoSplitting(Twinning)Sheep,Cattle,Primate(Rhesus)CatCloneDonor Surrogatemotherwithclone(CC)Outof87implantsonlyCCsurvivedtobirth

/news/science/2003-01-21-cloned-cats_x.htmDonor&CloneRainbow&CCClonedtransgeniccatcontainingredfluorescentprotein/story/_a/glowing-pig-passes-genes-to-piglets/20080109143909990001?ncid=NWS00010000000001TransgenicClones/news/2003/05/0529_030529_muleclone.htmlIdahoGem,firstclonedmule1sttry134implants2pregnancies,bothfailed2ndtry113implantations14pregnancies,onebirthSurrogatemother(horse)Transgenicplants按功能分类1、增产型转移或修饰生长分化、肥料、抗逆、抗虫害等基因达到增产效果。2、控熟型转移或修饰与控制成熟期有关的基因使GMO成熟期延迟、提前、不易腐烂,好贮存。3、高营养型改造贮藏蛋白质基因,使其表达的蛋白质具有合理的氨基酸组成。4、保健型转移病原体抗原基因或毒素基因至GMO,既补充营养又起到预防疫病的作用。5、新品种型不同品种间的基因重组形成新品种,GMO在品质、口味和色香方面具有新的特点。6、加工型：由转基因产物作原料加工制成,花样最为繁多。

转基因作物现状1983年:英国培育出世界上第一种含有抗生素药类抗体的基因移植烟草

1993年:美国将世界第1例GMC投入市场-保鲜延熟型西红柿目前商业种植的GMC:大豆、玉米、棉花、油菜、南瓜、木瓜、马铃薯、番茄、甜菜等几十种。世界GMC市场份额:美国孟山都（Monsanto）农产品公司占80％,德国安万特公司占7％,德国巴斯夫公司和瑞士先正达公司各占5％,美国杜邦公司占3％。国外转基因植物产业化现状1983年世界上第一例转基因植物在美国成功培植,标志着植物转基因技术的正式诞生.至今已有35科120多种植物转基因获得成功1986年首批转基因植物被批准进入田间试验,至今国际上已有30个国家批准千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达40多种1994年美国Calgene公司研制的转基因延熟番茄首次进入商业化生产1998年1月底,美国已批准30种转基因植物产品进入市场2001年全球转基因(GM-geneticallymodified)作物种植面积超过5,000万公顷2002年创出历史新记录,达5,867万公顷国外转基因植物产业化现状目前全球转基因作物种植面积最大的四个国家分别是美国、阿根廷、加拿大和中国.其中,美国种植3,570万公顷,阿根廷1,180万公顷,加拿大320万公顷,中国为150万公顷.这四个主要国家种植了全世界99%的转基因作物.美国是转基因技术应用最多的国家.自20世纪90年代初将基因改制技术实际投入农业生产领域以来,目前占美国农产品年产量70%的大豆、45%的棉花和40%的玉米已逐步转化为通过基因改制方式生产,其种植面积占转基因作物种植面积的66%.目前,大约有20多种转基因农作物的种子已经获准在美国播种,包括玉米、大豆、油菜、土豆和棉花目前全世界80%的转基因农作物出自孟山都(Monsanto)、杜邦等5家跨国公司.这些公司拥有相关基因、作物和种子的专利权,对转基因产品的市场拥有垄断性的控制权国内转基因植物产业化现状在国家“863”、“973”高新技术研究与发展计划及国家科技攻关计划的资助下,我国转基因作物的研究和开发取得了显著的进展,并且在基因药物、农作物基因图与新品种等方面具有相对优势,有些研究已经达到国际先进水平.但真正进入商品化生产的则较少,就农作物而言,已批准可进行商品化生产的转基因植物有四种:抗虫棉花、改变花色的牵牛花、延熟番茄和甜椒.其中,食品只有番茄和甜椒两种,甜椒由于缺乏优良品种实际上并未大量播种GMC在全球市场的价值1995年0.75亿美元1996年2.35亿美元1997年6.70亿美元2000年30亿美元2004年47.0亿美元2005年预计超过50亿美元2010年可望增至200亿美元

1.技术路线目的基因分离植物表达载体的构建受体材料的准备遗传转化转化组织组织脱分化转化植株筛选炼苗

1.目的基因的分离（1）已知基因的获得①化学合成法②PCR扩增（2）未知基因的获得①构建基因组文库，筛选目的基因②构建cDNA文库，筛选目的基因③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因……①②pGEM-T③④⑤⑥⑥⑦⑧①银杏叶RNA提取②反转录cDNA③chs全长cDNA的克隆④TA克隆及测序⑤向chs两端引入酶切位点⑥双酶切⑦定向克隆⑧导入农杆菌

2.植物表达载体的构建例pBI121-chs构建pBI121图谱银杏chs基因植物表达载体构建示意图chs

β-glucuronidose

NOSter

CaMV35Pchs遗传转化（1）间接转化法——农杆菌介导转化法

（2）直接转化法

A、基因枪转化法

B、电击法

C、花粉管通道法

D、PEG介导基因转化法根癌农杆菌

(Agrobacterium

tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包括Ri质粒)上有一段转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段DNA可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。基因枪转化法由美国Cornell大学的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化.。返回电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与DNA混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源DNA可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力.返回花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化.返回PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.返回转化组织——农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化受体植物叶盘侵染共培养筛选培养诱导成苗预培养叶盘，或愈伤组织一般流程如下：根癌农杆菌的培养、纯化→根癌农杆菌工程菌侵染液的制备→植物外植体的预培养→将根癌农杆菌工程菌接种到植物外植体的损伤切面→植物外植体与根癌农杆菌的共培养→植物外植体的脱菌培养→转化体的选择培养。农杆菌的活化挑单克隆进行培养、纯化收集细胞

用液体MS培养基重悬细胞将预培养的外植体放入菌液中共培养预培养的植物外植体工程菌共培养在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽（脱菌培养）转化体的诱导芽生长生根，形成转化植株生根，形成转化植株6.炼苗6.炼苗7.转基因苗的筛选与鉴定培养过程中利用标记基因筛选标记基因选择标记基因(Slectivegene)报告基因(Reportgene)抗生素类选择基因抗除草剂类选择基因生物安全性标记类选择基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)荧光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰转移酶基因(Cat)绿色荧光蛋白基因(Gfp)……Agrobacterium

tumefaciens,anaturalplantgeneticengineerSoilbacterium,relatedtoRhizobiumcausescrowngalls(tumors)onmanydicotsInfectionoccursatwoundsitesInfectedTobaccow/teratomaBriefrecitationinWeaver,pp.85-89complexbacterium–genomehasbeensequenced;4chromosomeswith~5500genesLotsofpili二、Ti质粒（Tumorinducedplasmid）环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解Ti质粒转移区(tra)：参与在不同农杆菌中的接合转移毒性区（Vir）：直接参与T-DNA的转移和插入植物染色体DNA复制区（Rep）：参与Ti质粒DNA复制

T-DNA

Ti质粒中仅有一部分进入植物细胞，T-DNAT-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧的25bp的正向重复序列，长约23kb右侧25bp重复序列对T-DNA的转移至关重要T-DNA可整合到植物染色体上，整合位点不具特异性auxA

auxB

cyt

ocsLBRBLB,RB–leftandrightborders(directrepeat)auxA+auxB–enzymesthatproduceauxincyt–enzymethatproducescytokininOcs–octopine

synthase,producesoctopine

T-DNA

Monocotsdon't