分子生物学学习资料：chapter4

4.1参考表4.1内容，确定下列限制性内切酶切口黏性末端（如果存在）的碱基数和种类（5’或3’突出）答：编号限制酶种类识别序列黏性末端碱基数黏性末端种类aAluIAG↓CT0无bBglIIA↓GATCT45cClaIAT↓CGAT25dKpnIGGTAC↓C43eMboI↓GATC45fPvuICGAT↓CG23gNotIGC↓GGCCGC45’4.2为什么需要将DNA连接到载体上再克隆？答：首先因为DNA本身在没有外界提供能量、酶等条件时，无法完全靠自己进行复制。所以我们必须将它加入到一个能提供复制条件并不断复制的细胞（或类细胞结构）中，例如细菌、噬菌体。其次，如果单纯的将所要复制的DNA注入到寄主细胞（hostcell）中，他会被认定为外来物质被解体，所以必须要将DNA插入一个载体，以使DNA能在寄主细胞（hostcell）中正常的复制。4.3试描述将一段DNA片段克隆到质粒pBR322的PstⅠ位点的过程？你怎么检测含有外源DNA的质粒？答：将一段DNA片段克隆到质粒pBR322的PstⅠ位点的过程：首先，用PstⅠ位点的限制性内切酶剪切质粒pBR322和外源DNA的PstⅠ位点，使他们产生黏性末端。然后，将剪切后的质粒和外源DNA同DNA连接酶一起温育，使质粒与外源DNA联结。最后，将DNA混合物转移到E.coli中，质粒在细菌中表达。pBR322包含两个抗生素抗性基因——氨苄青霉素的抗性基因和四环素的抗性基因。由于PstⅠ位点在氨苄青霉素的抗性基因上，所以有目的蛋白插入的克隆将不产生有活性的Amp蛋白，会对氨苄青霉素敏感。而所有在四环素平板上能长成的菌落都是含有完整的抗四环素基因质粒的。所以我们可以用影印平板培养法。在含四环素的正常平板上长出的菌落，用一种有吸附性的垫子转移到另一个含有氨苄青霉素的平板上，能在该平板上生长的菌落很可能是空载体，而不能生长的菌落则极可能是重组体。与前一平板对照后可以确定这样的菌落在前一平板上的位置，即检测到含有外源DNA的质粒。4.4描述如何将一段基因克隆到质粒pUC18的BamHI和Pstl酶切位点上，如何找出含有插入基因的阳性克隆。答：pUC18的MCS（multiplecloningsite）中只有一个BamHI位点和一个PstI位点，因此，先用两种酶BamHI与PstI分别酶切载体和目的基因片断，切出黏性末端，然后将两种酶切产物，施以DNA连接酶（DNAligase），使其连接，即可得到重组环状DNA（recombinantDNA）。含插入片段的载体的筛选方法：由于pUC18中含有氨芐青霉素，而且还含有lacZ’基因，其能合成β-半乳糖苷酶N段的α肽，筛选时使用含有编码β-半乳糖苷酶的C端基因的宿主细菌，其本身合成的β-半乳糖苷酶没有活性，但一旦含有未插入片段的pUC18时，即可生成有活性的β-半乳糖苷酶，能够分解半乳糖，而插入片段后的pUC18，lacZ’基因失活，即使进入到宿主体内也无法产生有活性的半乳糖苷酶；利用这一原理，将载体转移进宿主后，由于pUC仍有抗氨芐青霉素基因，所以，将这些含有载体的宿主培养在含有氨芐青霉素以及X-gal的培养基中，X-gal是一种人工合成的半乳糖苷，当β-半乳糖苷酶切割此物质后，其释放一个半乳糖并且显色将能合成半乳糖苷酶的菌落染成蓝色。于是将宿主细菌培养一段时间后，在培养基上选出白色（未被染色的）菌落，即为含有插入片段载体的宿主所产生的阳性菌落。4.5描述DNA片断插入Charon4载体的EcoRI位点的步骤：答：Charon4是λ载体中的一种置换载体，把DNA克隆入Charon4中的EcoRI位点的步骤是：1）用EcoRI把Charon4载体切开——在噬菌体DNA中部的三个位点切开，形成两个“臂”和两个“填充物”片断。2）通过凝胶电泳或者超速离心弃掉“填充物”而得到纯化的臂。3）在原来填充物的位置插入我们要插入的基因，并把插入基因和两条臂连起来。尽管两条臂可能没有和插入基因相连而使自己连接起来，但是由于两条臂的长度加起来太短了，不够12kb，因而无法将其放到噬菌体的头部。4）将重组ＤＮＡ和病毒Charon4的头尾以及其他组装所需要的因子，在体外将他们组装成为有活性的病毒。接着转染大肠杆菌，筛选阳性噬菌斑，通过复制产生大量重组DNA克隆并收集。4.6克隆1-kb的cDNA，本章中所讨论的载体中，哪些是适用的，哪些是不适用的？为什么？答：由于题目中复制的cDNA长度相对较短，故应选用质粒载体，而噬菌体载体、黏粒载体、酵母人工染色体（YAC）载体以及细菌人工染色体（BAC）载体均不适用。4.7要建立一个平均长度为45kb的DNA片段的基因文库，本章中讨论的哪种载体最为合适？为什么？答：因为黏粒载体（Cosmids）能插入的片段大小为40-50kb，故选用黏粒载体最为合适。4.8要建立一个平均长度大于100kb的DNA片段的基因文库，本章中讨论的哪种载体最为合适？为什么？答：由于该片段相对较大，故应选用细菌人工染色体（BAC）载体，因为其可插入的片段最大可达350kb。4.9你已经完成了一个用phagemid做载体的cDNA文库，说明你怎样从中筛选出感兴趣的基因序列。分别说明寡聚核苷酸探针法和抗体识别法。答：寡聚核苷酸探针法：前提是预先知道这个cDNA中基因的序列或者其表达产物的氨基酸序列。若是后者，则可以根据氨基酸对应的密码子确定该基因的可能序列情况及基因片断所来自物种的密码字偏好性，然后根据此序列合成寡聚核苷酸探针或简并探针，从而与cDNA文库杂交以找到特定的基因。抗体识别法：前提是需要构建在λgt11phage等里的cDNA文库（表达文库），以及针对该特殊基因表达所产生蛋白质的抗血清。1）在一个plate上很多λgt11phage被培养，并且在plaque当中释放出蛋白质。2）用nitrocellulose对应位置转移蛋白质并用抗血清检测。3）有抗体结合的那个plaque可以用被标记的Staphylococcusaureus探测出。4）自显影的方法确定出那个特殊的plaque，并对应原plate上的λgt11phage。这个方法不需要整个cDNA被克隆，因为抗血清是对抗体混合物可以识别许多该蛋白质的部分。4.10怎样从一个M13噬菌体载体获得单链的克隆DNA？从一个噬粒(phagemid)载体呢？答：1）首先DNA在噬菌体微粒中是单链的，但在侵入大肠杆菌后，它转变为双链。这条双链的DNA就是用来进行克隆的。当它被一个或两个限制性内切酶在多个克隆位点后，外来的带有一致末端的DNA就可以插入。这个重组的DNA接着被转入宿主细胞，产生大量的具有单链重组DNA的噬菌体。而这些噬菌体将被从宿主细胞中转移出来，然后这些单链的克隆DNA可以从培养液中收集出来。2）嗜粒特有的噬菌体和质粒。现在很通用的是pBluescript,它拥有多个克隆位点能够插入lacZ’基因，所以带有插入物能够通过X-gal染色（蓝白筛选）来区分。这个载体可以与能够进行复制的单链噬菌体f1（类似于M13）结合。这意味着一个包含重组嗜粒的细胞，如果在f1噬菌体（进行单链DNA复制）的帮助下，将会产生大量的单链嗜粒DNA，从而可以提取单链的克隆DNA。4.11图解如何创建cDNA文库。答：如下图所示创建cDNA文库的基本步骤，下面依次说明。1）一般使用真核mRNA创建。mRNA经过其poly(A)尾部与寡聚（dT）相结合，而从溶液中分离出来。制备的mRNA可以用麦胚轴提取液或者网织红细胞裂解液进行翻译后，再有聚丙烯酰胺凝胶电泳检测翻译产物的方法进行检验；其质量还可以用凝胶电泳进行直接检测，并通过回收凝胶甬道中特定区段按分子质量对mRNA进行分级分离。用杂交法可以将特异序列从mRNA中分离出来。2）cDNA的合成。第一条链的合成是通过向引物，通常为寡聚（dT）的3‘端进行添加脱氧核糖核甘酸，用反转录酶来合成mRNA的cDNA拷贝。合成反映可以由示踪法进行检测。用末端转移酶对cDNA第一链的3’端进行加尾很容易合成出全长的第二链。反转录酶或Klenow酶都可以与同聚物尾部退火配对来延伸引物。3）cDNA末端的处理。为了避免cDNA与载体间的平末端连接，通常用单链特异性核酸酶对cDNA末端进行处理，再用Klenow酶补平后加上接头。为避免当添加的接头被限制酶降解时cDNA被酶解。可以在添加前对cDNA进行甲基化处理。连接分子也可以用做接头的替代物。4）与载体的连接。载体通常被碱性磷酸酶去磷酸化以防止自连接，结果会促进重组分子的形成。质粒或噬菌体载体可以用于建cDNA文库，而噬菌体λgt11最适合于用作构建表达文库的载体。以上过程也可以用如下的简明流程图进行表示：Fig4.11cDNA文库构建示意图。4.12用图表说明切口平移（nicktranslation）的过程。答：首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动。过程见下图：Fig4.12切口平移（nicktranslation）示意图。4.13概述如何利用PCR技术扩增一段给定的DNA片段。答：1）模板DNA的变性：将给定的DNA片段经加热至95℃左右一定时间后，双链变单链，以便与引物结合；2）模板DNA与引物的复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3）引物的延伸：将温度固定在72℃左右，加入反应原料，在TaqDNA聚合酶的作用下复制合成与原给定片段相同的双链DNA；4）以新合成的DNA片段为模板，重复循环变性—复性--延伸三过程，就可以以指数速度扩增DNA片段。4.14比较反转录PCR（RT-PCR）和常规PCR之间有什么不同？RT-PCR的主要应用目的是什么？答：ReversetranscriptasePCR(RT-PCR)StandardPCR原理RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。应用对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交（RNAdot）等而言，RT—PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。另外，还能同时分析多个差别基因的转录。在植物方面，RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。对基因转录中剪切与拼接的检测：如果RT—PCR引物确定了mRNA片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点，用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。

聚合酶链式反应（PCR）过程这是一个指数增长的过程，上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。步骤首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，引物的选择随机引物：适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。OligodT：适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。基因特异性引物：与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。SuperScriptOne-StepSystem特别适合于与基因特异性引物连用。1.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

2.选择GC含量为40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。

3.设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。

4.避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。

5.避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

6.避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7.避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。4.15一种载体可以产生末端带有低聚组氨酸的融合蛋白，请描述其用途。并用图示表示在蛋白提纯过程中，低聚组氨酸标签的优点。答：融合蛋白的低聚组氨酸区域对镍等金属有着非常强的亲和性，所以带有低聚组氨酸的蛋白可以用含镍的亲和层析柱进行纯化，这种纯化方法既简便又快速。当含有重组DNA的细菌产生融合蛋白后，只需溶解细胞体，将提取液加入镍亲和层析柱，洗掉未连接的蛋白，再用组氨酸或是组氨酸的类似物咪唑洗下融合蛋白即可。因为带有低聚组氨酸的天然蛋白质非常稀少，所以用这种方法可以非常有效的提纯插入基因所表达的蛋白。该过程入下图：并且，从图示可以看出，当含有低聚组氨酸的融合蛋白被洗下后，可利用肠激酶切掉低聚组氨酸部分，则可得到所需的蛋白。肠激酶的识别位点非常稀少，所以可以保证目标蛋白其余部分不会被切掉。再将经酶处理后的蛋白通过层析柱，可将目标蛋白分离。所以该方法十分简便有效。Fig4.15含低聚组氨酸的融合蛋白的镍柱亲和纯化过程。4.16λ插入型载体与λ取代型载体之间的区别是什么？它们各自的优点是什么？答：1）区别：λ插入型载体（λinsertionvectors），即只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的λ载体。λ插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而λ替换型载体（λreplacementvectors）是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。λ替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA

2）各自优势：λ插入型载体：外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。因此，虽然λ插入型载体只能承受较小分子量的外源DNA片段的插入，但是它在检测重组DNA形