《药理实验方法学：体外实验方法综述》2800字

药理实验方法学：体外实验方法综述体外实验方法一：Westernblotting（蛋白免疫印迹实验）一、实验原理：贴壁细胞总蛋白的提取

蛋白样品的浓度定量

SDS电泳蛋白由凝胶转到固定相膜上一抗、二抗孵育曝光液浸润显影拍照实验材料：超净台、细胞刮棒、96孔板、移液枪、超速离心机、PBS缓冲溶液、裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA定量检测试剂盒、磷酸酶抑制剂、配胶架、配胶玻璃板、PVDF膜、特定的一抗、二抗，曝光液。二、实验步骤：

(一)细胞总蛋白的提取倒去培养皿中的培养液,用PBS清洗细胞；将培养皿微微倾斜，用细胞用胰酶或者直接刮下来，收集细胞悬液于离心管中，用记号笔做好分组标记；2500rpm离心10min富集细胞于离心管底部；倒弃上层液体，并用镊子夹取滤纸吸干离心管内的水份，倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干残留的水份；配置裂解液，按照比例加入相应的蛋白酶抑制剂。根据收集的细胞量往各离心管中加入一定体积的裂解液,于冰上裂解30~60min。然后，用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中(冰上操作)。4℃下12000

rpm离心30分钟。离心结束后，将蛋白上清分装标记，放于-20℃冰箱里储存。

(二)蛋白样品的初步定量

（1）取BCA定量试剂盒A液和B液，按1：50配置成工作液；（2）往96孔板每孔中加入200ul的BCA工作液和19ul的生理盐水和1ul的蛋白上清液，立即将96孔板放入37℃的烘箱里面孵育30min.。（3）打开酶标仪，调整好参数过后，将96孔板放入酶标仪进样架上，点击开始检测，记录读数。（4）用EXCEL处理好数据，加入对应量的裂解液和上样缓冲液配平各组的蛋白，然后在加热器上煮蛋白5min使之变性。

(三)

SDS电泳

仔细地检查玻璃板是否完整有无缺口，然后清洗玻板，避免有任何杂质的存在；将玻板对齐装入配胶架中然后放入配胶架上；按照试剂盒上的指南配好胶，用移液枪将胶液缓慢加入玻板夹缝中并预留一定的高度配制上层，然后加入异丙醇压胶，室温放置使凝固（避免气泡的产生）；等分离胶凝固后，倒去上层的异丙醇，直接加入上层胶，立即将梳子插入浓缩胶中。当上层胶凝固后,两手分别

抓住梳子的两边轻轻地向上将其拔出；将配好的胶板放入电泳槽中，加入电泳液并组装好电泳设备；根据实验情况往各孔中加入marker或者制备好的蛋白样品10ul~15ul；调节电泳参数，电泳时间一般1h~2h,电压为100

v。（四）转膜

（1）配置足量的转移液,另外准备200毫升的甲醇用于平衡凝胶和膜以及滤纸；（2）打开玻璃板，取出凝胶,切除多余的胶；（3）裁剪好膜，然后将膜放入甲醇中浸润激活1min；（4）依次将海缩垫、滤纸凝胶、膜按照顺序叠放好用玻璃棒去除其中的气泡；（5）组装好转膜设备调整参数，打开电源，一般电流为200

mA，转膜时间根据目标蛋白的分子量来定；

（6）转膜结束后用记号笔标注,以判断蛋白的位置和种类。（五)免疫反应

(1)将膜放入TPBS中清洗一段时间后,转移至含有封闭液的培养皿中封闭30min;

(2)将一抗用稀释液稀释后放入相应的容器中，将膜用TPBS清洗两到三遍后放入对应的抗体中4℃孵育过夜；

(3)稀释配置二抗,将孵育好一抗的膜放入二抗中孵育，然后用TBST在室温下脱色端床上洗3次,每次5分钟:；(六)曝光显影（1)将A和B两种试剂在培养皿中等体积混匀，然后将膜浸入曝光液中1~2分钟后放在玻板中，放入曝光仪准备曝光；(2)点击曝光机软件中的开始曝光，开始计时:根据信号的强弱适当调整曝光时间,选择不同时间观察曝光效果,以达最佳效果。Westernblotting实验操作步骤较多，核心环节很关键，例如细胞的药物处理是否合理将直接影响最终的实验结果，提蛋白时是否加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂将决定目标蛋白的检测结果是否有意义。此外配胶也是重要的环节，直接关系到后续的实验是否能够进行。电泳电压，时间也很关键，关系到是否能够有效的分离目标蛋白。除此之外，转膜的方式，参数配置和时间都影响目标蛋白的检测。一抗、二抗的质量和孵育方式、时间也会对实验的结果产生影响。因此，本实验的成败关键在于细心，操作细腻有条不紊才能获得理想的结果。

体外实验方法二：cck-8实验原理：cck-8是一种还原性的物质，细胞的线粒体内的琥珀酸复合体能够将其氧化代谢成橙黄色的物质，根据吸光度的大小可以计算出出细胞的相对活性变化。实验材料：96孔板，培养基，CCK-8试剂盒、酶标仪。实验步骤：（1）消化稀释细胞，制成悬液，计数计算，加入有一定体积的培养基稀释重悬；（2）一般用96孔板进行实验，设置一个空白对照，其他为实验组，每组可设置5~6个复孔。依次往每孔中加100ul中稀释好的细胞悬液。（3）种板过夜后，细胞生长密度适中时，吸出各孔培养基。空白组加不含药培养基，实验组加入含药物培养基。药物处理一段时间后，再次吸出各孔培养基。往各孔加入CCK-8占总体积10%的培养基.，放入烘箱中孵育一段时间后（时间根据预实验判断）将96孔板取出，放入酶标仪检测（波长设为450nm），记录读数进行细胞存活率和IC50计算体内实验方法一：小鼠皮下瘤的接种实验原理：基质胶配置细胞悬液用注射器注入小鼠颈部皮下成瘤后每天观察瘤的变化，测量瘤的长宽高，计算瘤的体积，对小鼠进行称重当瘤体积达到阈值时进行随机分组给药每天测量小鼠瘤的体积和体重实验结束后处死小鼠，取出肿瘤进行HE染色、免疫组化染色比较各组之间的差异实验材料：超净台、注射器、戊巴比妥钠、灭菌手术剪、酒精棉签、电子天平、基质胶、标尺实验步骤：细胞预处理：实验用到的细胞是HHCC827细胞，用胰酶消化下，加入培养基混悬后离心富集，然后按PBS和基质胶1:2的比例进行重悬配置成接瘤体系（细胞悬液的浓度为1X108个/ml）。麻醉：腹腔注射戊巴比妥钠（按7mg/Kg）用注射器吸取一定体积的接瘤体系，按每只裸鼠0.2ml进行接瘤。先用针头挑起小鼠的皮肤，沿着颈部平行缓慢进针，深度为3~4mm,缓慢注射入细胞悬液，然后缓缓退出针头。本实验的成败关键点是细胞悬液的制备，细胞的状态和浓度是非常重要的，细胞数太少无法成瘤，太多会导致裸鼠的死亡，此外注射的位置也很重要，通常位于裸鼠的颈部，若注射部位不合理，裸鼠可能会抓、咬接瘤部位，造成实验的失败。体外实验二：大鼠骨关节炎模型的建立实验原理：碘乙酸（Iodoaceticacid）注射入大鼠的骨关节出，诱发骨关节炎症注射0.2ml碘乙酸到大鼠关节腔，对照组注射生理盐水作为参照每天观察测量拍照记录关节处的颜色形态体积的变化情况，当关节处发生明显的变化后，检测大鼠关节的痛域分离剥出关节滑膜，进行拍照、HE染色、免疫组化分析实验材料:6~8周的SPF级SD大鼠，雄性，体重为150g~180g之间。实验步骤：将SD大鼠进行随机分组。模型组和药物组大鼠，注射0.2ml碘乙酸到大鼠关节腔，往对照组大鼠的关节腔注射生理盐水作为参照。每天对SD大鼠的关节处进行测量观察，拍照记录关节处的颜色形态体积的变化情况，记称重记录体重；将