专题九 作业（四）“基因工程”类主观题增分专练

专题九作业（四）“基因工程”类主观题增分专练1．(2023·海口一模)重叠延伸PCR技术是设计含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物，在PCR过程中，互补的核苷酸片段形成重叠，重叠的部分互为模板，通过多次PCR扩增，从而获得突变基因的方法。科学家将枯草芽孢杆菌基因组上的甘油激酶基因glpk编码的第270位氨基酸M突变为I，构建出了对甘油的利用水平大大提升的枯草芽孢杆菌，其原理如下图。请回答下列问题：(1)含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的__________________。通过PCR1获得产物AB需要进行______次的PCR扩增。(2)本实验获得点突变的目的基因两端为平末端，为便于构建基因表达载体，需要将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端，操作思路是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)获取目的基因后，构建质粒载体，形成基因表达载体。基因表达载体上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是________________，保证目的基因能正常转录的结构是________________。(4)对甘油激酶的改造属于________________工程的应用，其第一步是____________________。解析：(1)根据题图可知，含突变点碱基的互补核苷酸片段的引物是图中的b和c；PCR过程是核苷酸子链从5′端向3′端的延伸过程，从目标DNA链中PCR出产物AB需要进行3次PCR循环。(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接，可将限制酶BamHⅠ和SalⅠ的识别序列分别引入诱变甘油激酶编码基因的两端。(3)获取目的基因后，可将其与质粒重组。重组质粒上保证其能在宿主细胞中扩增的结构是复制原点，保证目的基因能正常转录的结构是启动子和终止子。(4)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，结合题意可知，对甘油激酶的改造属于蛋白质工程的应用，其第一步是预期蛋白质的功能。答案：(1)b和c3(2)将带有BamHⅠ和SalⅠ的识别序列的DNA片段用限制酶切出平末端，再使用T4DNA连接酶将其与突变产物的两端相连接(3)复制原点启动子和终止子(4)蛋白质预期蛋白质的功能2．野生型黑麦草细胞壁中较高的木质素含量会降低其作为青贮饲料的品质。D蛋白是催化木质素合成的关键酶，某研究小组通过构建含D基因部分序列正、反向片段的表达干扰载体(如图所示)，在细胞内产生双链RNA分子，诱导D基因的mRNA持续降解，培育得到低木质素含量的黑麦草。(1)D基因的正、反向目的片段的克隆：提取野生型黑麦草叶片全部mRNA，__________成cDNA。根据cDNA序列选取合适的片段，分别设计正、反向目的片段的上、下游________(填“相同”或“不同”)酶切位点、引物，正向片段和反向片段引物的扩增序列________(填“相同”或“不同”)，以使目的片段定向插入载体的特定位置。扩增产物经切下目的条带回收后与载体连接，形成克隆载体以用于正、反目的片段的扩增。(2)构建D基因的表达干扰载体：Ⅰ.对含有正向片段的克隆载体和反向片段的克隆载体分别进行双酶切，将回收片段与经相同酶切的中间载体用____________酶进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；为使干扰片段能在受体细胞中复制，中间载体需有____________。Ⅱ.将干扰片段和超表达启动子插入Ti质粒的__________________得到D基因的表达干扰载体，插入超表达启动子的目的是________________________________________________。(3)导入和培养：将D基因的表达干扰载体导入农杆菌。黑麦草愈伤组织在菌液中浸没5min，先置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，再转入无菌水浸润的滤纸上共培养3天，共培养的目的是________________________________________________。筛选得到的愈伤组织经____________过程，培育得到再生植株。(4)鉴定和筛选：对转基因植株与________________植株进行木质素含量测定与分析，筛选保留木质素含量显著______________的植株。解析：(1)提取野生型黑麦草叶片全部mRNA，通过逆转录过程合成cDNA。根据cDNA序列选取合适的片段，由于正、反向的D基因片段的碱基序列是不相同的且目的片段需定向插入特定位置，因而设计正、反向目的片段的上、下游的引物和限制酶切位点是不相同的，正向片段和反向片段引物的扩增序列相同，以产生双链DNA分子。(2)Ⅰ.对含有正向片段的克隆载体和反向片段的克隆载体分别进行双酶切，将回收片段与经相同酶切的中间载体用DNA连接酶进行连接，获得含有干扰片段的重组中间载体；中间载体需有复制原点，这样可以使干扰片段能在受体细胞中自我复制。Ⅱ.将干扰片段和超表达启动子插入Ti质粒的T-DNA中得到D基因的表达干扰载体，进而可使目的基因转移到受体细胞的染色体DNA上，插入的超表达启动子能促进正、反向目的片段(干扰片段)的转录，进而可得到足量的相应RNA分子，用于抑制后续的翻译过程，进而使黑麦草中木质素含量下降。(3)利用农杆菌转化法将目的基因表达载体导入到黑麦草细胞中，即将黑麦草愈伤组织在菌液中浸没5min，先置于无菌滤纸上吸去多余的菌液，再转入无菌水浸润的滤纸上共培养3天，共培养的目的是使携带干扰片段(目的片段)的T-DNA整合到受体细胞(黑麦草愈伤组织细胞)染色体DNA上，从而保证目的基因在黑麦草细胞中稳定存在。筛选得到的愈伤组织通过再分化过程，产生胚状体，进而培育得到再生植株，即转基因植株。(4)对转基因植株与野生型(或非转基因)植株进行木质素含量测定与分析，筛选保留木质素含量显著降低的植株，说明在该转基因植株中目的基因起到了应有的作用，因而需要将该植株保留。答案：(1)逆转录不同相同(2)DNA连接复制原点T-DNA促进正、反向目的片段(干扰片段)的转录，得到足量的相应RNA分子(3)使携带干扰片段(目的片段)的T-DNA整合到受体细胞(黑麦草愈伤组织细胞)染色体DNA上再分化(4)野生型(或非转基因)降低3．(2023·重庆二模)随着CRISPR/Cas9技术的出现，科学家已能在极短时间内对基因进行编辑，更改生命密码，揭示生命的运作原理。科学家研究发现利用这一技术能在许多方面为人类服务，比如利用转基因蚊子达到消灭蚊子的目的。(1)CRISPR/Cas9系统可以实现对双链DNA的精确切割，由三部分组成：crRNA、tracrRNA及Cas9蛋白，如图1。crRNA与tracrRNA结合形成sgRNA，sgRNA依据______________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割，造成DNA双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发________________。(2)研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和同源重组修复技术提高蚊虫群体中雄蚊比例，以达到有效控制雌蚊叮咬人类传播多种传染病的目的。同源重组修复是一种高保真的DNA双链断裂、修复技术，原理如图2，其过程为CRISPR/Cas9基因编辑系统切割使DNA特定部位的____________键断裂后，启动同源修复，使得DNA上的靶向序列被替换成所需序列。通过__________________技术将基因表达载体导入蚊子受精卵，该受精卵发育成雄性蚊虫。Cas9蛋白将对应的靶向序列进行切割，以基因表达载体中同源序列间的DNA为模板进行修复，最终实现子代都继承相应基因，使群体中雄蚊比例升高。(3)除利用转基因灭蚊之外，还存在寄生菌灭蚊技术。我国科研工作者在这一领域的研究取得了一些成果。当雄蚊被沃尔巴克菌感染后，精子会被细菌产生的毒素污染。健康雌蚊的卵细胞与这些“毒精子”相遇后，产生细胞质不相容效应，导致后代无法正常发育。相对于寄生菌灭蚊，利用转基因灭蚊的优势有_____________________________________________________________________________________________________________________(答出2点)。(4)目前我国尚不允许释放转基因蚊虫，请结合已学生物学知识解释原因：________________________________________________。解析：(1)图1中crRNA和tracrRNA结合形成sgRNA，sgRNA通过碱基互补配对原则与图2中的同源序列结合，引导Cas9蛋白对DNA进行切割。细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发基因突变，造成基因结构的改变。(2)CRISPR/Cas9基因编辑系统切割使DNA特定部位的磷酸二酯键断裂后，导致双链断开，随后启动同源修复，使得DNA上的靶向序列被替换成所需序列。常使用显微注射法将基因表达载体导入动物细胞受精卵。(3)寄生菌灭蚊技术需要使用致病菌感染雄蚊，污染环境。相对于寄生菌灭蚊，利用转基因灭蚊避免了引入致病菌，减少污染；目的基因能稳定遗传，无需代代操作，释放少量蚊虫即可起到控制作用；能够持续起作用。(4)转基因蚊虫有可能造成基因逃逸，扩散到自然界其他生物体内，导致基因污染等问题，故目前我国尚不允许释放转基因蚊虫。答案：(1)碱基互补配对基因突变(2)磷酸二酯显微注射(3)避免引入致病菌，减少污染；能稳定遗传，释放少量蚊虫即可起到控制作用；能够持续起作用(答出2点即可)(4)避免基因逃逸或转基因扩散引发的基因污染等问题4．(2023·房山区一模)花青苷可以决定苹果果皮、果肉等颜色的鲜艳程度，研究人员欲研究油菜素内酯(BR)对花青苷合成的影响及机制。(1)BR是一种天然植物激素，通过影响细胞基因的表达起到________作用。(2)A2基因为花青苷合成相关基因，为探究BR与A2基因之间的关系，研究者使用BR处理了苹果幼苗，检测A2基因的表达水平结果如图1，该结果表明_____________________。(3)有人提出A2蛋白和R1蛋白会影响花青苷合成酶(ANS)基因启动子的活性。研究者通过检测荧光素酶的表达量来验证此推测，进行了相关研究。①构建表达载体：请将选项的序号或字母填入图2相应的方框中。启动子：Ⅰ.A2基因启动子Ⅱ.R1基因启动子Ⅲ.ANS基因启动子Ⅳ.荧光素酶基因启动子Ⅴ.常规启动子基因：A.A2基因B．R1基因C．ANS基因D．荧光素酶基因②导入受体细胞：构建好的表达载体通过______________法导入苹果愈伤组织。③实验结果检测：实验结果如图3，结果表明____________________________________________________________________________________________________________________。(4)双分子荧光互补技术可研究细胞内蛋白质之间是否相互作用。将黄色荧光蛋白基因分为2段(片段1与片段2)，分别与可特异性结合的两种蛋白的基因融合构建表达载体，将两种载体同时导入受体细胞，在515nm激发光下可发出黄色荧光。研究者推测A2蛋白和R1蛋白在细胞内形成复合物发挥作用，进行如表所示操作，请写出可验证此推测的实验现象。载体组成实验现象____________________(5)综合以上研究结果，阐述BR对花青苷合成影响的作用机制______________________________________________________________。解析：(1)植物激素对于植物的生长发育起调节作用，BR是一种天然植物激素，通过影响细胞基因的表达起到调节作用。(2)据图可知，与对照组相比，BR处理后，A2基因相对表达量更高，说明BR促进A2基因表达。(3)①本实验要研究A2蛋白和R1蛋白是否会影响花青苷合成酶ANS基因启动子的活性，自变量为插入的基因种类，因变量为荧光素酶的表达量，根据图3可知，甲组是空载体做空白对照，乙组只有A2基因，那么丙组应该只有R1基因，因此载体2插入的目的基因应该为R1基因，即B；甲、乙、丙三组的变量为插入基因不同，其他应该相同，那么载体1和2的启动子都应该是常规启动子，即Ⅴ；本实验要研究的是A2蛋白和R1蛋白是否会影响花青苷合成酶ANS基因启动子的活性，因此还需要有ANS基因启动子，因此载体3处启动子为ANS基因启动子，即Ⅲ，因此图2相应的方框中序号或者字母为Ⅴ、B、Ⅲ。②将目的基因导入受体细胞，根