毒理学第五讲-生殖毒理学要点

外源化学物的生殖发育毒性及其评价9/16/20191第一节

概

述9/16/20192哺乳动物的生育繁殖过程外源化学物对生殖发育的影响外源化学物对生殖发育的影响以及损害作用的特点哺乳动物的生育繁殖过程9/16/20193生殖发育是哺乳动物繁衍种族的生理过程，其中包含生殖细胞发生，即精子发生和卵细胞发生、配子的释放、性周期胚泡的形成、植入或着床、胚胎形成、

胚胎发育、器官发生（或称器官形成）、胎仔发育、分娩和哺乳过程。生殖发育也可称繁殖过程。述和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、连续、完整的生殖发育过程的六个阶段A.从交配前到受孕：检查成年雄性生殖功能、配子的发育与成熟，交配行为、受精。B.从受孕到着床：检查成年雌性生殖功能、胚胎着床前发育、着床。C.从着床到硬腭闭合：检查成年雌性生殖功能、胚体发育、主要器官形成。D.从硬腭闭合到妊娠结束：检查成年雌性生殖功能、胎体的发育与生长、器官的发育与生长。E.从出生到断乳：检查成年雌性生殖功能、新生仔对宫外生活的适应性、断乳前的发育与生长。F.从断乳到性成熟：检查断乳后的发育与生长、对独立生活的适应、达到完全的性功能。9/16/20194外源化学物对生殖发育的影响9/16/20195干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程。外源化学物对生殖发育损害作用的特点9/16/20196生殖发育过程较机体其他系统更为敏感；外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。不仅直接涉及雌雄两个个体，同时还可以在其第二代个体表现出损害作用，而且

此种损害甚至在第二代以后的个体中表现出来。第二节

生殖毒性及其评定9/16/20197生殖毒理学历史生殖毒性生殖毒性的评价生殖毒理学历史9/16/201981950年美国霍普金斯大学医院发现，怀孕期间服用黄体酮，先后有600多名女婴出现生殖器男性化畸形。1956年用于治疗妊娠反应的反应停，1961年后出现近万例短肢畸形儿(海豹畸形)。二恶英(TCDD)造成的大面积污染及其与人群生殖危害的关系至今仍不清楚。生殖毒理学历史9/16/20199过去半个世纪震惊全球的系列中毒或灾难事件的发生，在世界范围内提高了人们对用药的安全意识，高度关注新的化学物对生殖内分泌系统或妊娠结局的不良影响，促进了与生殖内分泌系统安全相关法律的产生和研究方法指南的问世。生殖毒性表现9/16/201910外源化学物对生殖的过程的损害作用可以表现为性淡漠，性无能或各种形式的性功能减退。雌性可出现排卵规律改变，月经失调或失经，卵巢萎缩，受孕减少，胚胎死亡，生殖能力的降低不孕或不育等。雄性可表现为睾丸萎缩或坏死，精子数目减少。对雄性生殖系统的毒作用对睾丸的毒性的有害作用精子生成障碍性欲异常，丧失生育能力引起生殖细胞突变，造成可遗传损害直接损伤睾丸中的细胞群继发性的影响精子发生对精子发改生变下丘脑-垂体功能直接影响睾丸细胞功能9/16/201911对雌性生殖系统的毒作用生殖道的损害：影响运送卵子/受精/受精卵发育对下丘脑-垂体系统的损害：闭经，受孕力降低对卵巢的损害生长卵泡和成熟卵泡降低，排9/16/201912卵母细胞数下降/突变卵抑制，受孕力下降干扰卵巢内分泌，影响受精/着床/胚胎发育评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。是检查外源化学物对动物生育繁殖机能有无损害作用的试验。9/16/201913生殖毒性的评价主要是根据发育阶段的区别来设计的，每一段试验大致相当于上述两个阶段。I段：生育能力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验，主要反映妊娠前及妊娠初期的情况）II段：胚体—胎体毒性试验（致畸试验）III段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验，反映外源化合物对胚胎发育后期、母代分娩过程、哺乳期的影响）9/16/201914三阶段生殖毒性试验目的：评价受试物对配子成熟、交配行为、生育力、胚胎着床的影响（前述生殖周期的A和B阶段）。给药期：雄性从交配前4周开始染毒，并持续至交配成功；雌性交配前2周开始染毒（以覆盖3~4个动情周期）至妊娠第6天受精卵着床。9/16/201915I段：生育能力和早期胚胎发育毒性试验（一般生殖毒性试验）Ⅱ段：肧体-胎体毒性试验（致畸试验）9/16/201916目的：评价自胚泡着床到硬腭闭合阶段暴露受试物对妊娠母体和胚胎与胎仔发育的有害效应。包括母体毒性、胚胎或胎儿死亡、生长改变和结构异常。给药期：为着床期到硬腭闭合，即器官形成期；大、小鼠为受孕第6~15天，家兔为第6~18天。Ⅲ段：出生前后发育毒性试验（围生期毒性试验）9/16/201917目的：评价母体从着床至断乳期间接触受试物对妊娠/哺乳母体和对胎仔及仔代直至性成熟的有害效应。给药期：着床期开始，至仔鼠断乳。大鼠孕15天至产后28天。·受试动物：多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔·剂量分组:一般设立三个剂量组和两个对照组高剂量组产生轻微毒性症状，但其死亡率不大于10%，也不能完全丧失生育能力。相当于1/10LD50

。低剂量组则不应产生任何可观察到的损害效应。相当于高剂量组的1/30。9/16/201918•中剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。如果1000mg/kg体重剂量对生育能力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。一、一般生殖毒性实验方法原则·染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径9/16/201919•交配前雄性动物应染毒4-10周，雌性动物2周一般可混入饲料或饮水中，也可采用灌胃或胶囊法。·动物：至少采用一种动物，

推荐用大鼠；每组雌雄各20只；雌性动物妊娠13-15天处死，雄性交配成功处死。一、一般生殖毒性实验方法原则1.雄性生殖毒性评价动物实验精子生成分析（精子计数、形态学及存活率）精子功能检测睾丸标志酶活性检测交配实验显性致死试验9/16/201920评价方法9/16/201921小鼠精子头部是钩状！9/16/2019229/16/201923三代两窝F０（断奶或出生８周）2.雌性生殖毒性的评价F３bF３aF２b给予受试物８到１２周第一次交配第二次交配F１a观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况F１b断乳后给予受试物８到１２周F２a观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况断乳后给予受试物８到１２周9/16/201924两代一窝(和一代一窝)生殖试验出生第８周给予受试物（F０）第16-19周

雌雄交配F１（每窝选留幼仔８只，雌雄各半）断奶，给予受试物F１交配F２出生，每窝留８只幼仔F２断奶，检查发育情况9/16/201925·受孕率（％）:反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况·正常分娩率（％）:反映雌性动物妊娠过程是否受到影响·幼仔出生存活率（％）:反映雌性动物分娩过程是否正常·观察指标：9/16/201926·幼仔哺育成活率（％）:反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力·除上述４个指标外，还应该注意出生幼仔是否有畸形存在，对死亡的幼仔应进行畸形检查，可为下一步致畸试验提供参考·观察指标：9/16/201927基本概念致畸作用的毒理学特点致畸作用机理外源化学物发育毒性的评价9/16/201928第三节

发育毒性及其评定生殖是对亲代动物而言，从配子生成、受精到胎体分娩是一生殖过程。发育主要是对子代而言，从受精卵到性成熟的青春期甚至一直到衰老都属于发育过程。发育毒性也成为胚胎毒性。9/16/201929发育毒理学的发展简史畸胎学（古代）现代实验畸胎学（19世纪）发育毒理学9/16/201930畸胎学（古代）畸胎学是发育毒理学的基础。畸胎学作为一门描述性科学在文字之前就已经存在了，四大文明古国都有畸胎的记载。最早可以追溯到公元前6500年土耳其的联体婴儿石刻。5000年前埃及壁画所描述的唇腭裂和软骨发育不全等。当时人们相信出生异常的婴儿是上天的惩罚、星象的反应和未来的预兆，有的则以为是人和动物之间杂交的结果。随着16~17世纪生物科学的发展，才逐渐对畸胎有了科学的认识。WilliamHarvey于1651年提出了发育受阻学说，认为畸形起因于器官或结构的不完全发育。9/16/201931现代实验畸胎学（19世纪）现代实验畸胎学始于19世纪初，当时的胚胎学家使用各种物理因素（震动、倒置、针刺）和化学毒物处理鸡蛋，产生了畸形小鸡，有神经管缺陷、无脑、脊柱裂、独眼、心脏缺陷、位置颠倒和联体双胞胎等。他们还注意到作用时间在决定畸形类型方面比损伤的性质更为重要。9/16/20193220世纪早期20世纪早期发现多种环境因素（温度、微生物毒素、药物）可以干扰鸟、爬虫类、鱼和两栖类的发育。开始人们以为哺乳动物胚胎对致畸因子具有耐受性，要么直接致死，要么受母体的保护，对胚胎没什么影响。1935年，Hale首次报道维生素A缺乏诱导母猪产下突眼和腭裂的畸形后代。此后又有一些研究发现母体营养缺乏和许多环境因素，如氮芥、锥蓝、激素、抗代谢药、烷化剂、缺氧和X射线等可以引起哺乳动物畸形。9/16/201933重大历史事件9/16/201934是研究发育中的生物体从受精卵、妊娠以及出生后直到性成熟期间，由于暴露于外源性理化因素而产生的各种发育异常及其机制，为理化因素的危险度或安全性评价和预防措施提供依据的一门学科。9/16/201935发育毒理学developmental

toxicology基本概念1.

发育毒性(developmental

toxicity)指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。具体表现可分为:·生长迟缓:

即胚胎与胎仔的发育过程在外源化学物影响下，较正常的发育过程缓慢。·致畸作用:

由于外源化学物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表现形态结构异常。·功能不全或异常:

即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及行为的缺陷或异常。·胚胎死亡:

某些外源化学物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。9/16/2019362.

畸形、畸胎和致畸物·畸形(malformation):器官形态的异常。·致畸物或致畸原(teratogen):凡在一定剂量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。·畸胎(terate):具有畸形的胚胎或胎仔。·致畸试验:评定外源化学物是否具有致畸作用的试验。9/16/201937基本概念胚胎毒性作用(embryotoxicity)外源化学物引起的胎仔生长发育迟缓和功能缺陷不全的损害作用，对母体无显著的毒效应。（其中不包括致畸和胚胎致死作用。）母体毒性作用(maternal

toxicity)母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、出现某些临床症伏、直至死亡。9/16/201938基本概念母体毒性作用与致畸作用关系·具有致畸作用，但无母体毒性出现。·出现致畸作用的同时也表现母体毒性。·不具有特定致畸作用机理，但可破坏母体正常生理稳态。·仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。·在一定剂量下，既不呈现母体毒性，也未见致畸作用。9/16/2019395.畸形与变异·在胚胎或胎儿出现器官形态结构异常称为畸形。·机体的形态结构或生理功能，在同一物种的子代与亲代之间或子代的个体之间，有时出现不完全相同的现象，即为变异。9/16/201940基本概念致畸作用的毒理学特点9/16/201941器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感剂量与效应关系较为复杂·剂量效应关系复杂的表现及原因在一定范围内，畸胎率与剂量成正比，当高到一定水平引起胚胎死亡而掩盖了致畸作用，畸胎率反而会下降。·致畸作用的剂量反应曲线较为陡峭，斜率很大致畸带：从无作用剂量到胚胎死亡剂量的范围种属差异以及个体差异在致畸作用中较为明显·在不同动物并不一定都具有致畸作用，引起畸形的类型也不一致。·种间差异即同一物种中不同品系之间存在的差异，在致畸作用中也极明显。9/16/201942致畸作用的毒理学特点致畸作用机理9/16/201943Wilsom(1977)提出了畸形发生的9种机制，包括突变、染色体断裂、有丝分裂改变、改变

核

酸完整性或功能、减少前体或底物的补给、减少能源支持、改变膜特性、渗透压不平衡和酶抑制作用。近年来在分子水平的研究有很大的进展，虽然胚胎有代偿机制弥补外源性化学物的影响，但是，是否产生畸形依赖于在致病过程中的每个步骤在损伤和修复之间的平衡。二、Wilson发育毒理学基本原理（一）对致畸的易感性取决于孕体的基因型及其与有害环境因子相互作用的方式。（二）对致畸的易感性随着对有害因素暴露的发育时期的不同而变化。（三）致畸物以特异的方式（作用机制）作用于发育的细胞和组织，启动一系列的异常发育事件（细胞病理机制）。（四）有害影响能否接近发育中的组织取决于有害影响本身的性质。（五）异常发育的四种表型是：死亡、畸形、生长迟缓和功能缺陷。（六）随着剂量的增加，异常发育表型的频率和程度也随之增加，从无毒作用到全部致死。9/16/201944基因突变引起胚胎发育异常细胞死亡和增殖速度减慢细胞间通讯抑制胚胎中间代谢障碍胚胎组织中发育过程的不协调9/16/201945致畸作用机制外源化学物发育毒性的评价9/16/201946传统常规致畸试验·动物选择·剂量分组·动物交配处理·胎仔检查主要试验方案：三段生殖毒性试验主要用于评价药物的生殖发育毒性。一代和多带生殖毒性试验主要用于评价食品添加剂、农药及其他化学物的生殖发育毒性。由美国环境保护局（EPA）首先提出。改进的大鼠发育神经毒性的试验程序。9/16/201947外源化学物发育毒性的评价传统常规致畸试验9/16/201948·动物选择·剂量分组·动物交配处理·胎仔检查·动物选择:9/16/201949致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选择动物的一般原则，即食性和对受试物代谢过程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和繁殖及价廉外，还应特别注意妊娠过程较短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人类接近等特点。通常采用两种动物：一种啮齿类，首选大鼠；另一种非啮齿类推荐家兔。·剂量分组9/16/201950一般应先进行预试，目的是找出引起母体中毒的剂量。最少设3个剂量组，另设对照组。原则上最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%。最低剂量组不应观察到任何中毒症状；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。一般最高剂量不超过LD50的1/5～1/3，低剂

量可为1／100～1／30。·给药期9/16/201951在胚胎器官形成期连续给药（由胚胎着床到硬腭闭合），大鼠孕后6-15天，家兔6-18天。由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生器。·动物交配处理9/16/201952每组动物大鼠或小鼠为12～20只，家兔8～12只，狗等大动物3～4只。将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。出现阴栓或精子之日即为受孕0日，也有人作为第1

日。·胎仔检查9/16/201953自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。活胎、早起死亡胚胎（包括吸收胚胎）、晚起死亡胚胎的鉴别方法：（1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自然运动，机械刺激后有运动反应。（2）早期死亡的胚胎：胚胎的大小、外形和色泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胎盘形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全，呈紫红色，无自然动作。（3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动，机械刺激后无运动反应。9/16/201954下列几方面进行畸形检查：·外观畸形肉眼检查，例如露脑；·肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；·骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。9/16/201955·结果评定9/16/201956·活产幼仔平均畸形出现数: