第四章植物组织培养技术

04第四章植物组织培养技术2023/12/1第四章植物组织培养技术

植物离体繁殖（propagationinvitro）又称植物快繁或微繁，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。一、概念和特点（一）概念I概述

2第四章植物组织培养技术1、繁殖效率高。2、培养条件可控性强。3、占用空间小。4、管理方便，利于自动化控制。5、便于种质保存和交换。（二）特点3第四章植物组织培养技术二、植物快繁器官形成方式（再分化形成植株的方式）根据器官形成方式的不同，将植物器官的再生分为五种类型，即短枝发生型（不定芽型）、丛生芽发生型（器官型）、器官发生性、胚状体发生型和原球茎发生型。第四章植物组织培养技术（一）短枝发生型（不定芽型）

短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。特点：①繁殖率高，利用外植体的芽特别是原受到抑制的腋芽和大量形成不定芽。②能保持该种植物遗传稳定性。③可使繁殖周期长的林木缩短其童年期5第四章植物组织培养技术（二）丛生芽发生型(器官型)

丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状芽，或者直接从外植体上长出多个从芽，将单个芽转入生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要途径，它不经过愈伤组织，能使无性系后代保持原品种的特性，在生产中普遍应用。6第四章植物组织培养技术特点：①繁殖率非常高，但繁殖速度较慢。②遗传性稳定。7第四章植物组织培养技术（三）器官发生型（已讲过）是指外植体在适宜培养基和培养条件下，经过脱分化形成愈伤组织，然后经过再分化诱导愈伤组织产生不定芽，或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽，将芽苗转移到生根培养基中，经培养获得完整植株的繁殖方法。①繁殖速度较快。②遗传性不稳定，已产生变异。③愈伤组织是遗传转化、细胞培养或原生质体培养的良好材料第四章植物组织培养技术器官发生型也是许多植物快繁的主要方式。由于不定芽形成的数量与腋芽数目无关，其增殖率高于丛生芽发生型。但经过愈伤组织途径或者多次继代培养后，容易导致细胞分裂不正常，增加变异植株发生频率。如香蕉继代次数控制在8代之内，再生植株的变异率则可控制在3%左右。9第四章植物组织培养技术表现嵌合性状的植株通过此方式再生时，往往导致嵌合性状发生分离而失去原有价值。如观赏植物色彩镶嵌的叶子、带金边或者银边等性状的植物，通过器官发生性途径再生植株时，可能导致这些观赏性状消失。这类植株快繁时，应通过丛生芽途径进行。10第四章植物组织培养技术ABEC花烛叶片离体培养及植株再生11第四章植物组织培养技术（四）胚状体发生型

胚状体发生型是指外植体在适宜培养环境中，经诱导产生体细胞胚的繁殖方法，从而形成小植株的繁殖方法。分为间接途径（经愈伤途径）和直接途径两种。胚状体发生途径具有成苗数量大、速度快、结构完整的特点，因而是外植体增殖系数最大的途径。12第四章植物组织培养技术胚状体发生型特点：①胚状体发生数量多、速度快、结构完整、繁殖系数高。②遗传性稳定13第四章植物组织培养技术菊花花瓣体细胞胚胎发生及体胚发育过程的扫描电镜观察14第四章植物组织培养技术（五）原球茎发生型

原球茎发生型是兰科植物的一种快繁方式，它是指茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎（即扁球状体、基部生假根）的繁殖类型。15第四章植物组织培养技术原球茎是兰花种子发芽过程中的一种形态学构造。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，肿胀的胚呈小圆锥状，故称为原球茎。原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官，它可以增殖，形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根，叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。16第四章植物组织培养技术17第四章植物组织培养技术植物快繁的程序包括四个阶段：无菌（或初代）培养的建立繁殖体增殖芽苗生根小植株的移栽驯化II植物快繁程序18第四章植物组织培养技术一、无菌培养的建立这个阶段的任务是母株和外植体的选取、无菌培养物的获得及外植体的启动生长，以利于离体材料在适宜培养环境中以某种器官发生类型进行增殖。19第四章植物组织培养技术第四章植物组织培养技术21第四章植物组织培养技术二、增殖培养1.培养材料的增殖方式五种方式。(取决于培养目的和材料自身的可能性。)一般大多数植物采用无菌短枝或腋芽萌发或诱导不定芽产生，再以芽繁殖芽的方式进行增殖；兰科植物、百合等则采用原球茎增殖途径，以保障繁殖材料的遗传稳定性。22第四章植物组织培养技术2.增殖培养基增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。外植体在每次继代培养中，应能产生最大数量的有效繁殖体。基本培养基一般与启动生长培养基相同，而细胞分裂素和矿物元素的浓度水平则高于启动生长培养基。一般MS+BA1~3mg/ml+NAA0.1~1mg/ml。23第四章植物组织培养技术3.增殖体的大小和切割方法一般携带一个茎节，但第一次增殖的茎段一般都有2~4个茎节。茎段可以垂直插入培养基中，但插入的深度不应淹没茎节；或水平放入培养基表面，以刺激侧芽的萌动。24第四章植物组织培养技术 青花菜增殖 枇杷增殖第四章植物组织培养技术26第四章植物组织培养技术27第四章植物组织培养技术三、芽苗生根

将单个芽苗转移到生根培养基或适宜环境中诱导生根。1.离体生根（试管内生根）降低无机盐浓度（1/2MS或者1/4MS），减少或不需要细胞分裂素，增加生长素的浓度。对有些植物，如果芽苗在含有生长素的培养基中生长1～2d，再转移至无生长素的培养基中，或芽苗在含生长素的生根溶液中浸蘸后直接插入无生长素的培养基中，湿度85%以上，温度25℃，弱光或黑暗条件。28第四章植物组织培养技术29第四章植物组织培养技术2.活体生根（试管外生根）

芽苗先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培养5~10天，然后在温室中栽入培养基质，经常喷雾，给予高湿度环境，几天后便可自行生根。

30第四章植物组织培养技术四、移栽驯化

试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境。1.移栽2.驯化管理31第四章植物组织培养技术１.移栽

首先应洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物的繁殖污染，造成小苗死亡。然后将小植株栽入人工配制的混合培养基质中，基质用保湿又透气的材料，如蛭石、珍珠岩、粗沙、泥炭等按比例混合，以利小植株生长。几天后小植株可形成新的功能根系。32第四章植物组织培养技术2.驯化管理

移栽的试管小植株和活体生根的小植株，其湿度的控制十分重要。因试管苗在高湿（90％～100％的相对湿度）环境中生长，茎叶表面防止水分散失的角质层等几乎全无，根系又不发达，移栽后难以保证水分平衡，即使根系周围有足够的水分也不行。所以，应采用加覆塑料薄膜、经常喷雾的方法，提高小植株周围的空气湿度，减少叶面蒸腾。同时，逐渐降低空气相对湿度，使其适应自然环境条件。33第四章植物组织培养技术移栽小植株还应注意光、温控制。移栽初期光照强度应较弱，经过一段时间适应后，增加光照强度（漫射），如1500～4000lx，甚至10000lx。移栽小植株生长所需的适宜温度与植物种类有关，喜温性植物以25℃左右为宜，喜凉性植物则以18～20℃为好。温度过高导致蒸腾作用加强，水分失衡，微生物滋生等；温度过低则使幼苗生长迟缓或不易存活。如使基质温度高于空气温度2～3℃，则有利于生根和促进根系发育，提高存活率。34第四章植物组织培养技术此外，在移栽小植株的驯化管理阶段，还应防止菌类滋生，适当喷一定浓度的杀菌剂（杀菌灵）可有效保护移栽小植株的正常生长。35第四章植物组织培养技术36第四章植物组织培养技术III影响植物快繁的因素植物快繁的目的是以尽可能高的效率生产试管苗，获得最大的经济效益。因此，在快繁时应使各种影响因素处于最适合快繁的状态。37第四章植物组织培养技术一、外植体外植体的来源：最适的为茎尖、带芽茎段，也可以利用叶片、子叶、根段、花器官组织等。外植体生理年龄：幼嫩组织分化能力更强。外植体大小：不能太小，否则影响成活率。除非是用于脱毒苗的生产。38第四章植物组织培养技术二、培养基基本培养基：MS培养基应用最为广泛。对于某些植物及生根阶段，以1/4或1/2MS较好。蔗糖和葡萄糖浓度为2-4%。生根时稍低。植物生长调节剂：主要以细胞分裂素和生长素的配合使用，调节外植体的生长和分化。另外ABA、GA、CCC等也具有不同的作用。培养基的物理特性：以固体培养较为普遍，也有采用液体培养，如兰花原球茎的增殖。39第四章植物组织培养技术三、培养条件光照：1000-3000lx，后期可增强。14-16h/d。温度：与植物的原产地相应。一般为25±2℃。有时可进行高温或低温的预处理。湿度：要求环境相对湿度不能太低，一般在70-80%。气体：要求培养基及培养瓶通气良好，同时及时转接。液体培养要求振荡培养，促进氧气交换。40第四章植物组织培养技术四、继代培养主要指对阶段Ⅱ增殖形成的芽丛、胚状体或原球茎等进行转接继代。继代间隔时间一般为20天左右。41第四章植物组织培养技术五、移栽根系结构不完善的试管苗移栽后不易存活。要求根系结构完整，具根毛，再生根的吸收能力强。叶表皮组织不发达的试管苗也不易移栽存活。移栽要求打开瓶口驯化2-3天；或在瓶内添加一些生长延缓剂如PP333、CCC等培育壮苗。42第四章植物组织培养技术IV植物快繁的商业化应用

植物快繁最重要的用途是进行植物的商业化生产。世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。43第四章植物组织培养技术园艺植物种苗工厂化生产44第四章植物组织培养技术

一、商业化生产规模及工艺流程1.试管苗生产规模的确定

商业化生产规模的确定应以市场需求为标准。

试管苗生产规模的确定是以无菌工作台和培养架的数量来衡量的。年产100万株，接种室40~50m2，超净工作台8~10台，培养室100-120m2

。45第四章植物组织培养技术2.商业化实验室的设计

根据已确定的生产规模和组织培养的生产程序，试管苗生产的实验室应尽量布局合理，使生产程序能连续、有效地进行。（1）环境要求远离污染源（2）水电、交通（3）工艺流程（4）节能（5）无菌46第四章植物组织培养技术3.商业化生产的配套设施相应配套设施包括过渡培养室和露地炼苗场。47第四章植物组织培养技术4.商业化生产的工艺流程试管苗商业化生产的工艺流程是以其快繁程序为基础建立起来的，如最成熟的草莓脱毒苗生产流程和葡萄试管快繁流程。通过茎尖脱毒建立起来的草莓商业化试管苗生产，除必须配备的培养和驯化等条件外，还应增加病毒鉴定室。48第四章植物组织培养技术二、商业化生产及效益分析1.试管苗增殖率的估算试管苗的增殖率多数以芽或苗为单位，但原球茎或胚状体多以瓶为单位。（1）增殖率的理论值是指接种一个芽或一块增殖培养物，经过一段时间培养后得到的芽或苗数。Y=mXn

（Y—年繁殖数，m—无菌母株苗数，X—每个培养周期增殖的倍数，n—全年可增殖的周期数）（2）增殖率的实际值是指接种一个芽或一个苗，经过实际繁殖周期，得到的实际芽或苗数。实际增殖数与理论增殖数出现很大差异的原因是：①污染淘汰；②出售、转让和实验所用；③移栽死亡；④培养容器等设备的限制。49第四章植物组织培养技术2.生产计划的制定和实施（1）生产计划的制定

商业化生产计划制定的依据是市场对试管苗的种类、品种及数量的需求及趋势，实验室具备的生产条件和规模。首先应提出全年销售目标，再根据实际生产中各个环节的消耗，制定出相应的全年生产计划，一般生产数量应比计划销售的数量增加20％～30％。

50第四章植物组织培养技术（2）生产计划的实施

生产计划实施的步骤为：①准备繁殖材料。②合格繁殖材料的快速增殖。存瓶增殖总瓶数＝月计划生产苗数／每个增殖瓶月可产苗数

月计划生产苗数＝每个操作人员每天可接苗数×月工作日×人员数控制试管苗生产中的增殖总瓶数，便于在一个周期内全部更新一次培养基，使增殖材料处于不同生长阶段的最佳状态，提高其质量。51第四章植物组织培养技术

3.产品质量监控如接种状况、污染率、生长情况、生根苗数量、出瓶苗质量等，并建立试管苗出瓶标准。52第四章植物组织培养技术4.商业化生产效益分析

通过成本核算可以了解：①生产过程中的各种消耗；②管理工作的质量；③各项技术措施的效果；④产品价格的制定标准。53第四章植物组织培养技术

试管苗商业化的生产成本应包括：①人工费用。②生产物资费用。③设备折旧费用。④水电费用。⑤其他费用。54第四章植物组织培养技术三、降低商业化生产成本的措施针对试管苗生产所需的费用，应采取相应措施降低生产成本，增强产品竞争力，提高试管苗经济效益。1.提高劳动生产率2.减少设备投资，延长使用寿命3.降低消耗4.降低污染，提高繁殖率和成活率5.简化培养基55第四章植物组织培养技术四、离体快繁商业性生产的范围及应用1．用于稀缺或急需良种植物的繁殖2．用于茎尖脱毒及无病毒苗木试管快速繁殖3．用于自然界无法用种子繁殖或难以保持后代一致的三倍体、单倍体及基因工程植株的快速繁殖4．濒临植物的拯救5．用于种质的试管保存及交换56第四章植物组织培养技术兰科植物生产57第四章植物组织培养技术无菌苗快速繁殖58第四章植物组织培养技术无菌苗驯化59第四章植物组织培养技术60第四章植物组织培养技术五、商业化生产应注意的问题（一）污染

61第四章植物组织培养技术第四章植物组织培养技术1.污染概念：在组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。2.污染原因：细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。第四章植物组织培养技术（1）真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后3～10天才能发现。（真菌菌落大，颜色多样，表面呈毛绒状，嗅之一般有霉味，真菌会产生菌丝）原因：周围环境不清洁超净工作台的过滤装置失效培养用器皿的口径过大等为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防止污染的发生。

3.污染特点第四章植物组织培养技术（2）细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即可发现。（细菌菌落小，表面呈乳脂状光泽，嗅之一般有酸臭味，细菌污染没有菌丝）原因：材料带菌培养基灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使用前必须在火焰上烧红。第四章植物组织培养技术4.预防措施（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；材料预培养。（2）严格外植体灭菌（3）接种用具灭菌彻底（4）严守无菌操作规程（5）保持培养室清洁（6）做好超净工作台检修、养护第四章植物组织培养技术防止材料带菌的措施（1）用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预培养。

枝条→水洗净→插入无糖的营养液或自来水抽枝，以这种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污染。在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。第四章植物组织培养技术（2）多次灭菌法：如咖啡成熟叶片的灭菌即用这种方法。首先除去主脉（因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在），同时去掉叶的顶端、基部和边缘部分，这样可大大减少污染；其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中（商品漂白粉25%的溶液），灭菌30min；第三，在无菌蒸馏水中冲洗3次；第四，将材料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后，用蒸馏水洗3次。对层积过的种子也可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要灭菌，在层积贮藏的第一周还应增加1次灭菌处理。第四章植物组织培养技术（3）多种药液交替浸泡法对容易污染而难灭菌的材料：1.取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；2.将材料放入70%—75%医用洒精中灭菌数秒钟；3.1：500RoccalB（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min4.放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min；5.用无菌水冲洗5次。也可以在从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1mol盐酸（HCl）中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。第四章植物组织培养技术5.组培苗污染的处理（1）发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。（2）对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。（3）要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用后的处理第四章植物组织培养技术（二）褐变1.褐变的概念是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。2.褐变原因

木质素→→→→醌→积累造成毒害。多酚氧化酶[O]第四章植物组织培养技术3.影响褐变的因素（1）植物品种（基因型）木>草（2）生理状态材料年龄：幼龄期＜成年型材料大小：小材料＜大材料组织：细嫩组织＜老熟组织

（3）培养基成分

无机盐浓度过高、CTK水平过高外植体在最适宜的脱分化条件下，细胞大量增殖，抑制褐变。液体培养不容易褐变。PH高容易褐变。（4）培养条件

光照过强，温度过高，培养时间过长，加速褐变。

（5）材料转移时间长>短

第四章植物组织培养技术4.褐变的防止措施（1）选择适宜的外植体（2）选择合适的培养条件（3）外植体预处理（还原剂浸泡）（4）加快继代转接的速度（5）加抗氧化剂（VC、PVP、牛血清、牛蛋白）（6）0.1－0.5%活性炭第四章植物组织培养技术（三）玻璃化1.概念玻璃化是试管苗的一种生理失调症，在植物材料进行离体培养时，有些培养物的嫩茎或叶片呈现半透明或水渍状的现象。形态：植株矮小，节间短，叶水渍状、半透明、脆易碎。第四章植物组织培养技术2.原因：（1）激素浓度（尤其CTK）增加或CTK╱IAA高（2）琼脂浓度低（3）光照时间大于15h（4）温度低，湿度大（5）通风条件不好（6）培养基离子种类及比例不适宜第四章植物组织培养技术3.预防措施：（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。（2）适当降低CTK和GA的浓度。考虑加入适当的脱落酸。（3）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气，控制温度。（4）加入其他物质（如活性炭、多效唑、间苯三本分、根皮苷）。第四章植物组织培养技术（四）组培其它常见问题1.材料死亡2.黄化3.变异和畸形4.增殖率低下或过盛5.组培苗瘦弱或徒长6.不生根或生根率低7.过渡苗死亡率高第四章植物组织培养技术1.材料死亡原因与预防外植体灭菌过度灭菌浓度和时间适宜污染注意环境和个人卫生，严格操作培养基不适宜或配制有问题选用合适培养基培养环境恶化改善培养环境，及时转移和分瓶；加强组培苗的过渡管理第四章植物组织培养技术2.黄化（1）原因：培养基中Fe含量不足；矿物营养不均衡；培养环境通气不良，瓶内乙烯量高；激素配比不当；光照不足；糖用量不足，长期不转移；培养温