盐渍化生境中植物钙晶体和钙组分的测定

盐渍化生境中植物钙晶体和钙组分的测定

钙（ca2）在植物生长发育中起着中心的调节作用。在盐渍化环境中，ca2+土壤的浓度有所降低，但继续积累的ca2+可以缓解植物的压力。主要原因是ca2可以保护膜摆脱钠离子的损害，并尽可能限制植物吸收离子的过程中的na和k-e，以保持离子和水之间的平衡。ca2+可以调节原生质膜h-apollomh-apollom和h-ppel的活性，以提高抗盐压迫性。ca2+可以激活sos3蛋白（sos是零和7标签，sos蛋白是ras激生蛋白，是编码鸟苷释放蛋白的产物），sos3激活sos2，sos2激活sos1，na和k+运行系统。此外,植物体内还有一部分Ca2+与无机酸或有机酸结合,形成易溶、微溶或难溶于水的钙盐,如磷酸钙、硫酸钙、碳酸钙、果胶酸钙和草酸钙等钙盐,难溶的碳酸钙在细胞中常形成碳酸钙晶体(钟乳体),而难溶的草酸钙则形成草酸钙晶体.通常认为,草酸钙参与植物钙离子的调控并起解毒作用.在盐渍化生境中,当植物细胞内Ca2+浓度较高时,Ca2+与盐胁迫过程中产生的次生代谢物——草酸相结合,其沉淀为草酸钙晶体,草酸对植物会产生危害,但草酸钙是中性的;反之,当植物细胞内Ca2+浓度不足时,草酸钙会分解释放钙离子,以供植物生长.同时,草酸钙在气体交换、蒸腾作用和光合作用以及植防御保护和重金属的解毒等方面也发挥着重要作用.目前,有关细胞形成钟乳体的碳酸钙的生理生化作用尚不清楚.在植物体中,游离态的钙离子和结合态的钙盐合起来就是总钙.通常,植物体的总钙含量在0.1%~5%,且果籽和根部含量较少、茎叶含量较多.然而,衡量植物抗逆性的强弱一般不用植物体内总钙含量这个指标,而是用钙组分.于是,连续组分法就被用于测定植物体内的钙组分(水溶性钙、醋酸溶性钙和盐酸溶性钙).水溶性钙主要包括游离钙离子和一些易溶或微溶于水的钙盐,醋酸溶性钙主要包括碳酸钙、磷酸钙和果胶钙等,而盐酸溶性钙为草酸钙.笔者前期对腾格里沙漠干旱生境中25种植物钙组分的研究表明,随着植物演替进程,植物体内的醋酸溶性钙逐渐减少而盐酸溶性钙逐渐增多;多年生草本植物含有较多的水溶性钙,而灌木则有较多的盐酸溶性钙,说明植物钙组分对生境较敏感.在盐渍化生境中,植物的钙组分又会呈现出怎样的特征?为此,本研究选择天津市内54种植物进行钙晶体的镜检与钙组分的测定,并对其中8种乔木生长季的钙组分进行了分析,以揭示盐分生境中植物的钙组分特征,为天津市海防林的建设提供参考.1材料和方法1.1钙组分的测定试验植物均生长于天津市南开大学校园(39°10′N,117°10′E,海拔3m)内.该地区气候带为暖温带.年均气温12.3℃,1月平均气温-5℃,7月平均气温26℃,年均降水量628mm,降雨多集中在6—8月.土壤为潮土,土壤含盐量为0.41%,地下水位埋深在1m左右,土壤次生碱化显露.2008年10月17日,在南开大学校园内采集54种乔、灌木的叶片和枝条,置于标准固定液(FAA)中,带回实验室内用于镜检.同时,采集54种植物叶装入封口袋内,贴上标签,带回实验室后置于-70℃低温冰箱内保存,用于钙组分的测定.于2009年5—10月的每月25日,采集洋白蜡(Fraxinuspennsylvanica)、法国梧桐(Platanusacerifolia)、构树(Broussonetiapapyrifera)、合欢(Albiziajulibrissin)、黄金树(Catalpaspeciosa)、龙爪桑(Morusalbacv.Tortuosa)、洋槐(Robiniapseudoacacia)和榆树(Ulmuspumila)8种树木的叶片,放入贴有标签的封口袋内,密封,置于-70℃低温冰箱内保存,备用.在54种植物中,西府海棠(Malusmicromalus)、月季(Rosachinensis)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、木槿(Hibiscussyriacus)、紫薇(Lagerstroemiaindica)、火炬树(Rhustyphina)、忍冬(Lonicerajaponica)、大叶黄杨(Euonymusjaponicus)和小叶黄杨(Buxusmicrophylla)等乔、灌木的生长地段在夏季干旱时采用水管浇灌的补充灌溉,其他乔木生长地段不灌溉,依靠地下水和降水维持生存.1.2学习方法1.2.1观察方法在实验室中,分别取出FAA固定液中的样品,将每种植物的叶片做横切、茎做横切与纵切,分别制作3个临时装片,共9个,置于Leica13395H2X光学显微镜下观察.每个装片随机取3个视野,记录所观察植物晶体的形状和数量以及在植物组织中的位置.其中,钙晶体占显微镜视野内组织面积<5%记为“+”,5%~10%记为“++”,>10%记为“+++”,视野内没有观察到钙晶体则记为“×”.1.2.2钙组分的提取从-70℃低温冰箱中取出保存的样品,一个样品分别称取3份,每份0.05~0.06g,置于3个研钵中,用剪刀剪碎,分别向3个研钵中加入1mL的去离子水、1.05mol·L-1稀醋酸、1mol·L-1稀盐酸,研成匀浆,然后分别加入4mL相对应的处理溶液,用研磨杵搅匀,转入7mL的离心管中,7000×g离心15min,所得上清液即为钙组分提取液.取3个锥形瓶,先分别加入0.16、0.94和0.91mL的4mol·L-1NaOH,然后再分别加入1.84、1.06和1.09mL的去离子水,最后均汲取3mL提取液和3mL三乙醇胺(1∶2水溶液)分别加入锥形瓶中,配成体积为8mL的待滴定溶液.向待滴定溶液中加入0.08g钙指示剂,用10mmol·L-1钙标准液标定好的EDTA溶液滴定,边滴定边观察溶液颜色的变化,当溶液的颜色由紫红色变为亮蓝色时立即停止,此时即为滴定终点.每个样品设3个重复,取其平均值.同时用去离子水、稀醋酸和稀盐酸代替提取液,作空白滴定.1.3数据处理和分析54种植物按生长型进行统计,采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA),并用最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异(α=0.05).对8种乔木的钙组分进行聚类分析.用Excel2003软件作图.2结果与分析2.15不同植物叶中的钙晶体由表1可以看出,在盐渍化生境,54种乔木、灌木、藤本和草本植物中,有38种植物组织中镜检到较多的钙晶体,其中除无花果(Ficuscarica)中观察到由碳酸钙形成钟乳体外,其余均为由草酸钙形成的簇晶(19种)、方晶(26种)和晶鞘纤维(20种),仅在洋白蜡中观察到柱晶.不同植物钙晶体数量有很大差异.其中,相对耐水湿和耐盐碱的阔叶乔、灌木,如垂柳(Salixbabylonica)、法国梧桐、洋白蜡、毛白杨(Populustomentosa)、西府海棠、洋槐、月季、紫穗槐、木槿、紫薇、火炬树、忍冬、大叶黄杨和小叶黄杨等,体内的草酸钙晶体较多.藤本植物体内草酸钙晶体较少,草本植物和常绿乔木体内没发现钙晶体.由此可见,越适应盐渍化生境的植物,体内草酸钙晶体越多.将54种植物叶中钙组分按生长型统计表明,乔木、灌木、藤本和草本植物体内盐酸溶性钙含量逐渐减少而水溶性钙含量逐渐增多,醋酸溶性钙含量变化不明显(图1).显著性检验结果表明,草本植物与乔木和灌木体内水溶性钙含量之间有显著差异,但和藤本植物体内水溶性钙含量之间差异不显著;4种生长型醋酸溶性钙含量之间以及盐酸溶性钙含量之间的差异均不显著.草本植物体内的水溶性钙含量占总钙的70%以上,但木本植物体内的水溶性钙含量不足总钙的50%.2.2各树木其对盐分胁迫的认知在5—10月植物生长季,对天津市洋白蜡、法国梧桐、构树、合欢、黄金树、龙爪桑、洋槐和榆树8种乔木的钙组分进行了测定.结果表明,在盐渍化生境中,洋白蜡体内盐酸溶性钙含量明显高于水溶性钙和醋酸溶性钙;构树体内醋酸溶性钙含量明显高于水溶性钙和盐酸溶性钙;而榆树、黄金树、洋槐和合欢体内的水溶性钙含量明显高于醋酸溶性钙和盐酸溶性钙(图2).这表明钙离子在树木抵御盐分胁迫方面具有更重要的作用.聚类分析表明,就总钙和水溶性钙而言,洋白蜡、洋槐、龙爪桑和法国梧桐为一类,合欢和榆树为一类;就醋酸溶性钙而言,构树和榆树独门别类,其他6种为一类;就盐酸溶性钙而言,洋白蜡和榆树均独门别类,法国梧桐和合欢为一类,洋槐和龙爪桑为一类,构树和黄金树为一类(图3).3讨论3.1植物体内的草酸钙晶体植物钙晶体存在于晶细胞,晶细胞内钙晶体的沉积是生物矿化的一种形式,是一个涉及到具体生化和胞内代谢的过程.钙晶体的形成需要蛋白质和酶的参与,因而植物是否形成钙晶体与钙晶体数量的多少受遗传物质和环境因子影响.大量研究表明,草酸钙晶体在植物体内比较常见.本研究对32科54种植物钙晶体的观察发现,大多数植物体内都存在钙晶体,且晶体主要为草酸钙晶体.不同科属植物中草酸钙晶体的形状、数量和分布有所差异.在蔷薇科、蝶形花科等植物中,钙晶体含量丰富,主要类型为方晶和簇晶;而木犀科洋白蜡的晶体类型为柱晶.草酸钙晶体主要存在于植物的叶和茎中,但具体分布位置不同,这印证了草酸钙晶体的形状和分布具有种间差异性和种内特异性.这说明在盐渍化生境中,植物会通过吸收土壤中的钙离子,中和体内有毒的草酸,进而形成中性无毒的草酸钙.同时,碳酸钙晶体(即由碳酸钙形成的钟乳体)仅在桑科植物无花果的叶中观察到,在另一种桑科植物构树的叶中并未发现.Nakata认为,草酸钙晶体普遍存在于被子植物中且含量丰富.在本研究中,尽管大多数植物体内均发现有草酸钙晶体,但在一些科属植物中并未发现.我们将54种植物按生长型乔木、灌木、藤本和草本进行统计发现,不同生长型植物体内的草酸钙晶体数量有较大差异.落叶乔、灌木体内的草酸钙晶体较多,藤本植物体内较少,而草本植物和柏科、松科等常绿植物体内并未镜检到草酸钙晶体.显然,本研究结果并不完全支持Nakata的草酸钙晶体普遍存在于被子植物的观点.草本植物也属被子植物,但其体内并未镜检到草酸钙晶体.本研究表明,落叶乔、灌木体内草酸钙晶体较多,草本植物体内没发现钙晶体;笔者前期研究表明,在干旱生境中,灌木、半灌木体内有较多草酸钙晶体,多年生草本体内没发现草酸钙晶体,两种生境镜检结果基本一致.由此可见,在落叶乔、灌木中,草酸钙晶体较普遍,是一种基本的生物矿化物质;而常绿乔木体内没有发现钙晶体,其原因有待深入研究.这说明落叶乔、灌木通过形成草酸钙来抵御盐分胁迫,而草本植物和常绿乔木通过生理活性钙来抵御盐分胁迫.在盐渍化生境中,落叶乔、灌木和草本植物体内的草酸钙晶体数量存在差异,其原因可能有两方面:一是落叶乔、灌木的生长周期长,当体内积累较多草酸的时候,就需要形成草酸钙以中和,继而形成草酸钙晶体;而草本植物生长周期短,完全可通过每年的枯落物排除多余的草酸物质.二是落叶乔、灌木根系发达,占据深层土壤位置,为了抵御盐分胁迫,不得不吸收更多的Ca2+,植物体内较多的Ca2+和草酸为形成较多的草酸钙晶体奠定了基础;而草本植物根系较小,占据土壤上层位置,容易吸收更多雨水以降低体内盐分离子的浓度来抵御盐分胁迫,其体内的草酸钙浓度不足以形成草酸钙晶体.因此,植物生长型的差异可能是导致植物钙晶体数量差异的原因之一.进一步分析得知,在本研究中,相对耐水湿和耐盐碱的乔、灌木体内草酸钙晶体较多.也就是说,越适应盐渍化生境的植物,其体内草酸钙晶体越多.因此,草酸钙晶体的形成是植物对盐渍化生境的一种生理适应机制.3.2不同植物对盐分胁迫的适应性在植物钙组分中,水溶性钙主要是游离态的Ca2+,醋酸溶性钙主要是易溶或微溶于水的生理活性钙盐,而盐酸溶性钙是难溶于水的草酸钙钙盐.游离态Ca2+广泛参与植物各种生理生化过程,在干旱生境中,它稳定细胞壁结构、维持细胞膜透性和提高保护酶活性以及调节植物的光合;在盐渍化生境中,它维持细胞膜透性、促进离子的选择性吸收、调节Na+和K+转运体系.尽管目前对生理活性钙盐的作用尚缺乏明确定论,但对草酸钙的生理、生态作用有很多报道.然而,由于Ca2+和草酸钙在抵御盐分胁迫方面机制不同,不同植物水溶性钙与盐酸溶性钙含量的差异预示着其抵御盐分胁迫的机理也不同.所研究的54种植物中,从乔木、灌木、藤本到草本,4种生长型植物体内盐酸溶性钙含量之间的差异均不显著,但其盐酸溶性钙含量却逐渐减少,意味着草酸钙在乔、灌木抵御盐分胁迫中具有重要作用.这与钙晶体观察结果相一致.另一方面,从乔木、灌木、藤本到草本,水溶性钙含量逐渐增多,且草本植物体内水溶性钙含量显著高于乔木和灌木,草本植物体内的水溶性钙含量占总钙的70%以上,而乔、灌木体内的水溶性钙含量不足总钙的50%,说明Ca2+在草本植物抵御盐分胁迫中也起着重要作用.可见,水溶性钙在草本植物体内占有优势而盐酸溶性钙在乔、灌木体内占有优势.根据《中国主要树种造林技术》,本研究选择的54种植物中,洋白蜡、法国梧桐、柽柳、垂柳、构树、合欢、黄金树、龙爪桑、洋槐、榆树、毛白杨、