1例抗凝血酶缺陷症先证者及其家系遗传分析

1例抗凝血酶缺陷症先证者及其家系遗传分析

抗凝酶（at）是人体抗凝酶的主要因素之一。大约占抗凝酶系统总活性的70%，它可以诱导凝血酶、凝血酶和其他激活的凝血因子，如凝血酶和饱腹。遗传性AT缺陷症是一种常染色体显性遗传性疾病,为静脉血栓形成的主要遗传性危险因素之一。本文对1例遗传性AT缺陷症患者进行临床表型诊断、家系调查、实验诊断和基因诊断,发现了1种新的引起AT缺陷症的模式,即同一等位基因复合杂合突变导致遗传性AT缺陷症。1数据和方法1.1髂总静脉血栓形成史先证者,男,55岁,2010年8月因肺炎合并肺栓塞入院,静脉造影显示左髂总静脉血栓形成。既往有反复下肢静脉血栓形成史,45岁时首次发病,曾使用尿激酶溶栓治疗3～4次。家族史阳性,其父40多岁时突发脑血管疾病去世;其兄、弟、妹均有反复下肢静脉血栓形成史。其他家系成员没有血栓形成事件发生。家系图见图1。1.2血浆c活性检测Ag和AT:A及其他相关抗凝因子活性检测先证者及家系成员分别用负压静脉采血1.8ml,1∶9枸橼酸钠抗凝,立即4℃、3000r/min离心10min后收集上层血浆。AT:Ag检测采用免疫比浊法(美国BeckmanCoulter公司试剂盒,美国Array360仪器)。AT:A和蛋白C活性(PC:A)检测采用发色底物法。蛋白S活性(PS:A)检测采用凝固法(德国西门子公司试剂盒,日本Sysmex7000全自动血凝仪)。1.3各组dna提取先证者及其家系成员枸橼酸钠抗凝外周血,应用天根生物科技(北京)有限公司DNA抽提试剂盒,严格按照说明书操作提取基因组DNA。1.4pcr引物信息使用Primer5引物设计软件设计AT基因1、3、4、6和7号外显子和侧翼序列的扩增引物,2和5号外显子序列参照文献报道,引物信息见表1。PCR总体系为25μl∶1×缓冲液,dNTP终浓度为0.2mmol/L,引物终浓度为0.2μmol/L,Taq酶1.25u,模板DNA50ng。95℃预变性5min,然后95℃30s,62℃30s,72℃30s,32个循环,最后72℃延伸10min。1.5pcr扩增和测序验证PCR产物由北京六合华大基因科技公司纯化和测序。测序图采用Chromas软件进行比对分析,突变序列经反向测序证实。家系成员则仅在先证者中发现的AT基因突变区域进行PCR扩增和测序。针对先证者2个新的突变位点,对100名正常人DNA,PCR扩增相应突变位点并测序,以排除基因多态性。2结果2.1ps蛋白和ps活性先证者AT:Ag和AT:A分别为114mg/L和54.8%,PC和PS活性分别为94.7%和91.9%。其家系成员相关检测见表2。2.2编码蛋白的arg、ser和agt对先证者AT基因7个外显子及侧翼序列的测序结果比对发现,先证者AT基因第2外显子区存在两处变异,c.134G>A和c.342T>G(图2),将分别导致编码的AT蛋白Arg(CGG)被Gln(CAG)所替代(p.Arg13Gln)和Ser(AGT)被Arg(AGG)所取代(p.Ser82Arg)。对该家系其他8名成员的AT基因第2外显子测序发现,6名成员与先证者存在相同突变(表2)。2.3名妇人的相应位点针对先证者AT基因的突变位点,通过测序100名健康人的相应位点,未见相同变异,排除了突变位点为基因多态性的可能。经数据库检索,c.134G>A和c.342T>G为新的突变位点。3i型遗传at缺陷症遗传性AT缺陷症是由于编码AT蛋白的基因(SERPINC1)突变所引起的一种常染色体遗传病,多为显性遗传,是静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism,VTE)的主要遗传性危险因素之一。遗传性AT缺陷症在人群中的发生率为2/104～5/104,而在VTE患者中的发生率高达1%～8%。遗传性AT缺陷症分2型:I型主要表现为AT抗原(AT:Ag)和活性(AT:A)的同步减少,Ⅱ型是由于AT结构异常所致。本家系先证者有反复发作的血栓病史,其兄、弟、妹也有相似病史,其母AT的活性和抗原均正常,而其父40多岁时突发脑血管疾病去世。实验室检查先证者AT:A和AT:Ag为114mg/L和54.8%,均为参考值的50%左右,而PC:A和PS:A均正常。基因检测结果显示,AT基因第2外显子存在两处错义突变,分别为c.134G>A和c.342T>G,其兄、弟、妹、1个侄子、两个侄女均存在该两种突变,故诊断为I型遗传性AT缺陷症。先证者及其三个兄、弟、妹均在40岁左右首次发病,而携带突变的3个子代均无血栓病史。VTE是一种多因素的疾病,包括遗传性因素和获得性因素,而年龄是最主要的获得性危险因素。调查发现,VTE的发病率随年龄增长而显著上升,儿童VTE的发病率为每年1/100000,而老年人(年龄>70岁)可高达1%,这也许是本家系Ⅲ1、Ⅲ3和Ⅲ4目前未表现VTE的主要原因。本家系先证者AT基因第2外显子区存在两处突变。由于携带突变的4名亲代均在该两处位点上发现相同的突变,且他们的子代或者是不存在任何突变,或者是存在两种相同的突变,根据孟德尔遗传规律之分离律推测,先证者的两种突变位于同一条染色单体上,即两种杂合突变来自于同一等位基因。纯合子和复合杂合子I型AT缺陷症患者往往不能存活,目前报道的纯合子AT缺陷症均为Ⅱ型。本例先证者虽然是复合杂合子I型AT缺陷症,但因为两处杂合突变只累及一条染色单体,另一条正常的染色单体可以合成AT,所以先证者仍然具有50%左右的AT:A和AT:Ag。这是一种新的引起Ⅰ型AT缺陷症的模式。曾报道Ser82Asn引起的I型AT缺陷症,对Ser82Asn进行表达研究后发现,Ser82Asn导致AT在胞内滞留,分泌减少,并认为82位氨基酸额外糖基化可能会阻碍AT翻译后的折叠,从而导致I