仔猪胃中细菌及乳酸杆菌的动态变化

仔猪胃中细菌及乳酸杆菌的动态变化

0肠道菌群的整合母乳喂养前后的动物肠道菌群发展迅速，不稳定型，容易导致大量肠道疾病。这是幼年动物易感染疾病(如腹泻)的一个重要原因。关于胃肠道菌群已有研究报道,主要集中在肠道,对胃内菌群变化的研究还未见系统报道。胃作为消化器官,除了有消化、吸收营养物质功能外,还能够产生酸性环境,对从口腔进入宿主的病原菌起屏障作用。以往研究胃肠道菌群主要依靠分离、培养等传统手段,然而有报道认为,很多微生物利用现有的培养方法不能分离和鉴定或者无法培养。近年来,一种基于16SrDNA的序列多态性的技术,正被广泛应用于各种生态系统中的细菌群落研究,包括哺乳动物的胃肠道系统。因此,作者以仔猪为供试动物,利用基于16SrDNA的PCR/DGGE及序列分析等技术,研究其从7日龄至35日龄(断奶后2周)胃中细菌及乳酸杆菌的数量及菌群变化,从而为幼年动物胃肠道菌群研究提供更多的信息。1材料和方法1.1不同方法对冷鱼的免疫3窝初生杜×长×大仔猪(#1、#2和#3)按常规饲养管理,仔猪于21日龄断奶,断奶后赶走母猪,仔猪自由采食、饮水,实验猪不进行免疫,断奶前不饲喂开食料,断奶后食日粮不含抗生素。分别于7、14、21、24和35日龄,每窝随机屠宰一头仔猪,以无菌方法于冰面上收集胃食糜,置于-20℃冰箱保存。1.2胃艺术法将适量胃食糜装入7mL离心管内,用pH计(Ecoscan,Singapore)直接测定其pH值。1.3细菌16srdna的pcr扩增参照Zoetendal等的方法,先用珠磨法机械破碎样本,而后用酚和氯仿/异戊醇提取其总DNA。采用一对细菌通用引物U968f(5P-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3P)和L1401r(5P-CGGTGTGTACAAGACCC-3P)对细菌的16SrDNA的V6～V8区片段进行PCR扩增。采用巢式PCR扩增乳酸杆菌16SrDNA的特异片段,两对引物分别为Bact0027f(5P-GTTTGATCCTGGCTCAG-3P),Lab0677r(5P-CACCGCTACACATGGAG-3P)和Uni0515r(5P-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGATCGTATTACCGCGGCTGGCA-3P),Lab0159f(5P-GGAAACAGGTGCTAATACCG-3P)。1.4pcr扩增及引物筛选参照Koike等方法,将提取的样本DNA,分别连续作4倍梯度稀释,吸取1μL作为模板,进行PCR扩增,引物分别为细菌通用引物U968f和L1401r,乳酸杆菌特异性引物Bact0027f和Lab0677r。利用含Goldview染料的1.2%琼脂糖电泳检测PCR产物,凝胶成像系统拍照。1.6带的特定序列的测量和分析参照Collier等2结果2.1h值稳定性21日龄(断奶)之前,仔猪胃食糜pH值比较稳定,维持在3.0左右。而断奶后,pH值显著上升,达到5.0,并且至断奶后2周还保持稳定(图1)。2.2冷却系统pcr检测以细菌通用引物进行PCR扩增,仔猪哺乳期胃食糜细菌总DNA,在各稀释梯度未能检测到产物;而断奶后,仔猪胃食糜细菌总DNA稀释45倍后,还能检测到其PCR产物。以乳酸杆菌特异性引物(Bact0027f,Lab0677r)进行dilution-PCR,7～24日龄样本DNA原样,均未检测到产物,而35日龄样本DNA稀释42倍后,还能检测到PCR产物(图2)。2.3dppe图谱断奶前,仔猪胃食糜细菌DGGE条带较少,优势条带属于高GC含量细菌;断奶后,DGGE图谱中的条带数明显增多,并且出现一些新的优势条带,而断奶前的优势条带消失(图3)。相似性分析表明(图4),7、14和21日龄的DGGE图谱间的相似性在80%以上,24和35日龄的DGGE图谱间的相似性也在45%以上。2.4优势条带消失7、14、21和24日龄仔猪胃食糜乳酸杆菌DGGE图谱有较多相同的优势条带,而至35日龄一些优势条带消失(图5)。相似性分析表明(图6),14、21和24日龄的DGGE图谱间的相似性超过90%,它们与35日龄及7日龄的DGGE图谱间的相似性,也分别在75%和50%以上。2.5两组患者s1、s1和ss3的比较通过对断奶后3日龄样本DGGE图谱中的优势条带进行回收,并对其进行测序,我们得到三种优势细菌的16SrDNA序列片段:即S1、S2和S3。通过互联网与GenBank进行同源性比较发现,S1、S2和S3分别与Escherichiafergusonii(98%,371/378,DQ157369),EscherichiacoliK12(99%,371/372,DQ157370)和Streptococcusgordonii(99%,384/386,DQ157371)有很高的相似性。此外,利用DGGE将样本与已知克隆进行匹配,我们鉴定出条带S4和S5均属于Streptococcussuis,其相似性与序列号分别为100%、652/652、DQ256406和96%、1460/1519、DQ256404。3认同乳酸杆菌的形成环境本研究表明,仔猪断奶后胃内pH值会显著升高,这与断奶应激和采食日粮有关,并且至断奶后2周,仔猪胃中的pH值仍维持在较高水平,这可能与本实验中未在断奶前给仔猪添加开食料有关。断奶引起仔猪消化道内环境改变的另一个重要方面,表现在菌群的变化。有研究表明,断奶后仔猪小肠中乳酸杆菌数量下降,而总细菌数量及肠杆菌(特别是大肠杆菌)的比例上升。本实验结果表明,断奶后仔猪胃中的菌群数量显著升高,并且优势菌属于Escherichia和Streptococcus属,它们是引起仔猪发病的潜在病原菌。这一变化,也可能正是引起小肠菌群变化的一个重要原因。仔猪在哺乳期,胃中pH值较低,能抑制从口腔入侵的病原菌;而断奶后,胃内pH值显著升高,不仅对病原菌的抑制作用消失,而且病原菌还能够利用胃中的营养物质大量繁殖。尽管大肠杆菌在整个肠道中都存在,但是小肠前段是引起大量液体及电解进入肠腔的主要感染位点。如果胃中大肠杆菌大量繁殖,必然增加其在小肠前段定值的机会。本研究中,哺乳期仔猪胃中细菌数量较低,优势菌群为相对高GC含量细菌,推测其为乳酸杆菌。乳酸杆菌属于高GC含量细菌,能耐受较低pH值环境,并且还能够发酵胃中的乳糖而生成酸,对于维持胃内酸性环境起着一定的作用。断奶后3天内胃中乳酸杆菌的数量以及种类虽未发生显著的改变,其在菌群中的比例却明显下降,而至断奶后2周,其数量有所上升。这可能是保障肠道健康的条件之一,但此时乳酸杆菌的种类却减少。本实验结果提示,通过对幼年动物胃中内环境的调控如降低值和改变菌群区系将是解决幼年动物病原性腹泻的一个有效途径。1.5引物扩增产物的酶催化酶染色参照Muyzer等方法,对PCR扩增产物进行DGGE分析。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝胶(含丙酰胺、二丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油),对于通用引物扩增产物,尿素浓度梯度为38%～48%,对于乳杆菌引物扩增产物,尿素浓度梯度为35%～45%。电