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冠心病abca1基因多态性的研究

三磷腺苷配合箱战舰子a1(pt-whys1)是一种完整的膜蛋白。这些以pt为能量,在逆胆固醇旋转(rct)和高密度血脂(hdl)之间的初始阶段发挥重要作用。他被称为rct防守,并在抗动脉硬化方面发挥了作用。ABCA1基因的突变可以引起Tangier病(TD)和家族性HDL缺乏(familialhypoalphalipoprotein-emia,FHA),而ABCA1基因的一些常见的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)对血脂、动脉粥样硬化的产生和冠心病的严重程度也有很大的影响。本实验组通过聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)结合DNA测序的方法对112例冠心病患者进行了ABCA1基因全部编码区50个外显子的检测,发现一个国内外尚未报道的新SNP位点,并对先证者进行了家系调查,同时还发现6个已报道的SNP位点,现将研究结果报告如下。数据和方法1.菌株年龄、性别分布均为汉族人,分为冠心病组及正常组。冠心病组:选取2004年9月至2005年8月广州市南方医院心内科住院确诊的冠心病患者112例,男79例,女33例,年龄(60.8±11.3)岁,其中行冠状动脉造影确诊55例,经临床症状结合心电图、超声心动图、平板运动实验及心肌灌注同位素发射计算机断层显像(ECT)表现证实57例。均排除严重肝、肾、肿瘤等疾病。正常组:108例,其中男性74例,女性34例,年龄(59.9±7.9)岁。经询问病史、体检、实验室检查(血、尿、便常规,血脂,血糖,肝、肾功能)、心电图、胸片等检查排除冠心病、高血压、糖尿病、肿瘤和严重的肝、肾疾病。两组年龄、性别差异无统计学意义。家系调查人群中先证者为冠心病组患者,其他家系人员不包括在冠心病组及正常组内。2.提取氨基酸基因的dna外周静脉血3ml,乙二胺四乙酸二钠(EDTANa2)抗凝,用基因组DNA提取试剂盒(天为时代公司)提取基因组DNA。3.pcr扩增条件引物由上海英骏公司合成,扩增50个外显子。PCR反应体系25μl,含提取DNA1μl、10×Buffer2.5μl、Taq酶1.25U、2.5mmol/LdNTP2μl、10μmol/L上、下游引物各1μl。PCR反应条件:95℃预变性120s;94℃变性30s、55℃~62℃退火60s、72℃延伸60s,共35个循环;72℃终末延伸10min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。4.mda的合成用PCR产物行SSCP检查。以30%聚丙烯酰胺贮存液配成8%非变性聚丙烯酰胺凝胶,9μlPCR产物加入1μl10×碱变性液(50mmolNaOH,10mmolEDTA),在室温变性10min后,再加入10μlLoadingBuffer(0.05%溴酚蓝,0.05%二甲苯青蓝,95%甲酰胺,0.5mol/LEDTANa2)于98℃变性10min后4℃骤冷上样。4℃恒温循环水条件下200V电泳14h左右。以10%冰醋酸固定15min,去离子水冲洗2~3次,0.2%硝酸银染色15~20min,去离子水冲洗2~3次,再用3%氢氧化钠(内含0.005%甲醛)显色至适度(信号强、背景浅),结果照相并干胶保存。5.ddntps法SSCP发现异常条带的PCR样本送至上海英骏公司,使用377测序仪采用4种ddNTPsDye-Terminators法,在同一反应管中完成循环测序反应,再在同一电泳道中分离检测。6.酶切位点设计SSCP及测序发现异常的样本,在正常组行酶切检查确定此改变是否为SNP,同时在冠心病组行酶切检查并与正常组比较,明确其临床意义。根据酶切位点设计新的引物序列:上游5′GCAAGGCTACCAGTTACATT3′;下游5′TGTCCAAGGAAAAGCCTCAC3′。CviAⅡ酶切反应体系20μl,含PCR产物10μl、限制性内切酶CviAⅡ0.5μl、10×缓冲液2μl、去离子水7μl。置于25℃恒温水浴箱中16h,2%琼脂糖凝胶电泳。PCR产物为240bp,酶切后产物长度为146bp和94bp。结果1.s1292gm133v新位点112例冠心病患者ABCA1基因50个外显子检查发现1例患者外显子7存在异常条带(图1),经序列分析我们发现并证实了ABCA1基因外显子7中新位点的改变(图2),此新位点的改变为A1092G;氨基酸改变为M(甲硫氨酸)233V(缬氨酸)。108例正常人发现4例存在A1092G位点的改变,发生率为3.7%,112例冠心病患者发现2例存在A1092G位点的改变,发生率为1.8%,结果证实A1092G(M233V)新位点为SNP,但两组间发生率差异无统计学意义(P>0.05)。我们同时证实中国人ABCA1基因也存在已报道的R219K、V771M、T774P、K776N、M883I、R1587KSNP位点(图3)。2.陈旧性下壁心肌梗死先证者(编号1)为65岁男性,湖南籍。心电图表现为Ⅱ、Ⅲ、aVF导联典型异常Q波,胸前导联ST-T改变。结合超声心动图等资料诊断为陈旧性下壁心肌梗死。其父母及两个哥哥均已去世,其中一个哥哥死于心血管疾病,另外三人死因不详。其一个姐姐(编号9)也存在基因改变,并也曾因陈旧性下壁心肌梗死入院治疗,其他成员无明显心血管疾病。其家系16人ABCA1基因外显子7检测共发现5例存在基因改变,分别为编号1、5、6、9、14的家族成员(图4),占31.3%。3.责任指标dl-c、极低密度胆固醇的tg、tg、tg、tg、tg、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、l-c、dl-c、dh-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-c、dl-先证者(编号1)血脂水平表现为血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)均增高,尤以TG增高明显。先证者曾患心肌梗死的姐姐(编号9)TG增高,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低,另一例(编号14)血脂五项中TG增高,另外四项指标均正常。编号5患者,除LDL-C降低外,其余血脂指标检查均正常(表1)。ag型相关基因的基因型及突变三磷酸腺苷结合盒转运蛋白超家族是ATP-bindingcassette(ABC)的简称,是一组利用ATP作为能源,在细胞间和细胞内转运底物的蛋白质。大多数ABC是膜蛋白,可以转运多种物质:包括脂类、固醇、代谢物及跨越细胞内膜及外膜的各种药物。此家族成员数量繁多,底物多样,其共同特点是都能结合并水解ATP,应用释放的能量转运各种分子。ABCA1是ABC超家族中的一员。人类ABCA1基因定位于9q31,长度149kb,含有1453bp启动子及50个外显子,组成由2261个氨基酸组成的膜蛋白(图3),相对分子质量为254000,由两个跨膜部分组成。ABCA1基因不同位点的突变引起TD或FHA,易早发动脉粥样硬化、冠心病。这些突变可发生在ATP结合区、N末端编码序列等处。已证明ABCA1主要功能是参与逆胆固醇转运,其cDNA碱基的改变有可能导致编码氨基酸的改变,从而导致其功能改变。SNP系指人类基因组中大量存在的单个核苷酸的差异。核苷酸序列的一定差异决定了不同人种和不同个体的差异,以及不同人群疾病易感性和药物治疗敏感性的差异。因此,SNP是一个具有高度稳定性的遗传学标记,可以成为寻找疾病相关基因,进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。目前至少报道了50个ABCA1的突变点,包括23个错义突变,6个无义突变,21个插入或缺失突变。我们在以前的工作中曾首次发现了ABCA1基因介于内含子12和内含子14之间的1221bp和内含子16和内含子31之间的19.9kb的双缺失突变和A935H错义突变。资料显示所有突变都导致脂质流出的下降,在被检测的突变中,磷脂和胆固醇流出的高度相关性说明ABCA1对两种脂类的流出都有影响,说明ABCA1基因可能直接或间接介导磷脂和胆固醇的跨膜转运。M233V型ABCA1基因改变在国内外均未见相关报道,此位点cDNA位置为A1092G,由于碱基改变而导致氨基酸由甲硫氨酸(M)转变为缬氨酸(V)。此位点改变与R230C突变位点,R219KSNP位点均位于外显子7,位于第一个细胞外大环内(见图3)。有研究显示ABCA1两个细胞外环状结构可能为ApoA1提供一个潜在的结合目标,受损的ABCA1结合子可能阻止浆膜与ApoA1之间的相互作用;此外,细胞外环氨基酸发生改变也有可能导致了ABCA1蛋白三级结构的破裂,从而阻止了其与浆膜之间的相互作用。DNA测序结果和限制性酶切分析结果表明,我们检测到的位点改变的基因型均为AG型。在我们所调查的家系里,AG型发生率为31.3%(5/16),说明M233VAG型SNP的发生具有家族倾向性,其家系中二人有心肌梗死病史(均为M233VAG型SNP),一人

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