植物病原线虫种快速分子鉴定

植物病原线虫种快速分子鉴定

20世纪80年代，生物技术在各个领域得到了广泛应用，分子诊断也成为植物线虫研究的一种新形式。直接测定线虫的遗传物质(DNA)是潜在的最有力的线虫诊断工具,因为DNA诊断技术并不依赖于基因组的表达产物,也不受环境影响和线虫发育阶段的限制。在植物线虫的分子诊断和鉴定中,最有价值的基因组区域之一是核糖体DNA(rDNA)重复单元,rDNA编码和非编码区的比较分析正在成为许多生物的种和亚种鉴定的普遍工具。1pcr扩增植酸酶基因序列在大多真核生物核基因组中,每个重复rDNA基因家簇从5′到3′端的结构是由外转录间隔区(ExternalTranscribedSpacer,ETS)、18S基因、内转录间隔区(InternalTranscribedSpacerRegion,ITS)、5.8S基因、28S基因和基因间隔区(IntergenicSpacer,IGS)6部分组成,IGS区域连接着另一个rDNA基因家簇的拷贝。ITS序列是一个多用途的遗传标记,位于18S和28S核糖体DNA基因的重复簇之间,中间被5.8S核糖体DNA基因分开。rDNA是核DNA基因组中度重复簇的一个组分,在基因组中有100~500个拷贝,总长度为7~13kb,且18S、5.8S和28S基因组序列在大多数生物中趋于保守,在生物种间变化小,而内转录间隔区ITS1和ITS2变化较大,基因间隔区IGS的序列变化最大使生理小种之间差异显著。这样就很容易通过PCR扩增更多变异性和分类学上有价值的ITS区域的片段,使从单条线虫进行PCR扩增变得简单易行。通过PCR技术,设计特定的引物对线虫rDNA的ITS区进行扩增,然后用限制性内切酶酶切扩增产物,将酶切片段进行多态性(RFLP)分析,或者用随机引物扩增,进行全基因组随机扩增DNA多态性(RAPD)分析,还可以进行扩增的限制性片段长度多态性(AFLP)分析。当用“通用”PCR引物扩增时,任何单一线虫种都能提供ITS区的扩增产物。因此,任何线虫种、群体和线虫群落生态演替都能用基于rDNAITS区域的分子途径来进行分析。当土壤混合群落中含有大量的幼虫阶段、当线虫的性别是二态性时,或当遇到不熟悉的线虫时,标准的分子标记对于线虫识别特别有用。在生态学研究中,来源于单头线虫的ITS的PCR-RFLP分布图可能是检测样品中线虫多样性的一种方法,同时也为线虫比较和鉴定提供一个标准的、关键性的有用分类特征。2rena-has-pcr技术在植物寄生虫谱的分子诊断中的应用2.1剑线虫组内群体的结构分析剑线虫是一类可以传播植物病毒的线虫,传毒效率因种而异。Vrain等最先根据秀丽小杆线虫(Caenorhabditiselegans)的18S和28S基因序列分析结果设计了一对保守性引物扩增16个美洲剑线虫(X.americanum)群体rDNA-ITS区,均得到大小约为1500bp的扩增产物,用限制性内切酶AluI、BamHI、DdeI、HinfI、MboI及MspI酶切扩增产物,经RFLP分析揭示了该美洲剑线虫组内群体的复杂系统分类。Judith等利用剑线虫rDNA中的18S基因高度保守的特性,用引物INRA扩增来自德国无毒苗栽培的葡萄园中剑线虫3个种X.index、X.diversicaudatum和X.vuittenezi不同群体的rDNA-ITS区,测序结果显示这3种剑线虫的种间变异比较小。同时,他还对来自世界各地的长针科线虫rDNA的18S进行扩增、测序,很容易地将剑线虫属(Xiphinema)和长针线虫属(Longidorus)分开,并区分了X.americanum、X.pachtaicum和其它剑线虫组内的不同群体,揭示了剑线虫和长针线虫的两个属的亲缘关系,得出Xiphinema和Longidoruscamelliae的亲缘关系最近,与L.litchi的亲缘关系次之。2.2细胞谱和pcr扩增对子扩增的扩增胞囊线虫是农业上一类重要的病原线虫,根据寄主范围、形态学、繁殖方式及染色体数等特征,甜菜胞囊线虫(H.schachtii)和大豆胞囊线虫(H.glycine)都归为甜菜胞囊线虫组。为了揭示这两种胞囊线虫的种间差异,Ferris等扩增了这两种线虫rDNA的两个ITS区,比较了它们核苷酸序列的差异,得出胞囊线虫属内的遗传距离,并用该技术构建了胞囊线虫的系统进化树。Subbotin等用通用引物AB28和TW81扩增了胞囊线虫的25个有效种、一个未知种和一个Meloidoderaalni的ITS区,得到1010bp和1060bp的2种大小的DNA片段,证实了禾谷胞囊线虫的ITS存在“A”型和“B”型现象,并用26种限制性内切酶酶切扩增产物,结合其中的7种内切酶将这些重要的胞囊线虫种相互区分开来。他们也首次描述了一种基于双倍PCR技术用种特异性引物快速诊断和鉴定大豆胞囊线虫幼虫和胞囊的方法,应用两组引物扩增来自中国、俄罗斯、美国和巴西的52个大豆胞囊线虫群体的rDNA,第一组引物含有两个通用引物D3A和D3B,用于28S扩增核糖体基因的D3扩展区后得到大小约345bp的片段;第二组引物包括大豆胞囊线虫种特异性引物GlyF1和一个通用引物rDNA2,用于扩增ITS2区的片段和部分28S基因后得到一个大小约181bp的特异性片段,而且能从大豆胞囊线虫的单个胞囊或单条2龄幼虫的微量DNA中扩增出特异性片段,灵敏度很高。Amiri等用两种引物TW81和AB28扩增甜菜胞囊线虫的ITS区,并用两种限制性内切酶MvaI和ScrFI得到的RFLP片段成功区分了甜菜胞囊线虫(H.schachtii),H.betae,H.trifolii和H.medicaginis。在中国,已经开展了胞囊线虫核糖体DNA中ITS区的研究。彭德良等报道了中国小麦禾谷胞囊线虫的rDNA-ITS,应用AB28和TW81扩增出1060bp的ITS区片断,用HinfI酶切后揭示了中国小麦禾谷胞囊线虫与摩洛哥禾谷胞囊线虫群体间的RFLP差异,并且证实了番茄是中国大豆胞囊线虫的新寄主;郑经武等报道中国大豆胞囊线虫群体的rDNA-ITS,用通用引物扩增出1060bp的DNA片断,ITS区PCR-RFLP研究表明ITS区在大豆胞囊线虫种间是稳定的。2.3测序和测序研究根结线虫的鉴定是植物线虫分类的重要组成部分,国外已经应用rDNA-ITS区进行根结线虫的快速分子诊断和从混合种群中识别根结线虫种。Blok等用引物5S和引物18S扩增爪哇根结线虫、花生根结线虫、南方根结线虫、玛雅圭根结线虫(M.mayaguensis)和北方根结线虫的rDNA中18S和5S之间的ITS区域,从爪哇根结线虫、花生根结线虫和南方根结线虫中扩增出715bp的ITS产物,从玛雅圭根结线虫中扩增出831bp的ITS产物,从北方根结线虫中扩增出的ITS最小,仅为564bp,从而有效地揭示了种内和种间变异Schmitz等用通用引物5367、5368、F194和F195扩增M.chitwoodi、M.fallax、M.hapla、M.incognita、M.javanica、M.naasi群体的rDNA-ITS区,均得到一条大小约760~800bp的片段,然后用17种限制性内切酶酶切扩增产物,用RFLP技术分析了不同种的多态性片段,并用RAPD技术构建了这些种的遗传距离图,有效揭示了根结线虫种间变异。Waeyenberge等用Tru91酶切比利时根结线虫群体的ITS扩增产物,成功区分了M.chitwoodi、M.fallax和M.hapla,并用RAPD技术检测了这些根结线虫群体的遗传距离,构建了亲缘关系的系统树。国内根结线虫的rDNA研究也刚刚开始,彭德良等用PCR技术对来自中国的10个根结线虫群体进行rDNA-ITS-RFLP及其序列的研究,应用通用引物F195和5367扩增出一条约700bp的DNA片段,并结合形态学特征和形态测量值将这些群体诊断为4个常见种和象耳豆根结线虫(M.entrolodii)。廖金玲等对根结线虫的核糖体DNA的ITS区进行研究,通过对荧光AFLR片段分析和对18S基因组、ITS区、26S基因组的扩增、克隆、测序一系列分析,成功地鉴定出M.arenaria、M.incognita、M.javanica和最近描述的一个新种M.panyuensis。赵鸿等也用该技术扩增来自中国不同地区的13个根结线虫群体并用限制性片段长度多态性分析,揭示了由于地理条件、气候、环境等因素造成我国的M.incognita和M.javanica群体跟巴西、意大利的M.incongnita和M.javanica群体的rDNA-ITS存在异质性。2.4p.niglctus和p.volnus的遗传相似率短体线虫是农业上较重要的一类植物线虫,Pinochet等用20个引物扩增短体线虫Pratylenchusvulnus的7个群体,其中6个引物扩增出来的ITS区产物,经RAPD技术分析可以检测这7个群体间的变异,同时也成功地鉴定出了P.neglectus与P.vulnus,并测出这两个种间的亲缘率只有0~0.06,而P.vulnus群体间的遗传相似率高达0.9。Waeyenberge等用保守性引物rDNA1和rDNA2扩增了18种短体线虫的rDNA-ITS产物,得到约900~1250bp的DNA片段,揭示了在短体线虫种间ITS的长度和大小差别较大。用5种限制性内切酶CfoⅠ、DdeⅠ、HindⅢ、HpaⅡ、PstⅠ酶切ITS扩增产物,结合至少两种酶将所有的18种短体线虫相互区分开来。Siciliano-Wilcken等用rDNA-ITS-RAPD技术成功区分了来自巴西加啡、香蕉、柑桔、观赏植物上的短体线虫P.coffeae和P.penetrans的不同群体。2.5植松材线虫和拟松材线虫的重新扩增pcr廖金玲等用rDNA-ITS-PCR扩增松材线虫和拟松材线虫的rDNA的ITS区,分别得到大小约为220bp和330bp的DNA片段,有效揭示了这两种线虫ITS的大小和变异。张立海等用两个引物扩增松材线虫和拟松材线虫的rDNA-ITS区,得到ITS1区的扩增产物大小约308bp,该区可作为松材线虫PCR鉴定的靶序列,并且测出这两个种间的ITS差异很大(为32~39bp),而松材线虫种内差异很小(不超过1bp)。郑经武等也得出了相同的结论:他们用5种限制性内切酶AluⅠ、CfoⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ酶切松材线虫和拟松材线虫(B.mucronatus)的rDNA-ITS区扩增产物,经RFLP分析得到的特异性谱带,成功检测出了来自宁波的这两种线虫,并且检测出它们的种间差异大,而种内差异很小。2.6胞囊线虫遗传关系和亲缘关系研究马铃薯金线虫(G.rostochiensis)和马铃薯白线虫(G.pallida)是马铃薯的主要病原物,快速准确鉴定这两种线虫及其小种是包括检疫措施在内的综合防治马铃薯胞囊线虫病的基础。Fleming等应用Vrain设计的引物扩增G.rostochiensis和G.pallida的ITS区并用PCR-RFLP揭示了种内和种间变异,这一途径已扩展至测定马铃薯金线虫、马铃薯白线虫和烟草胞囊线虫复合种和其它球胞囊线虫种的相关性。Ferris等对球胞囊线虫属中5个种的rDNA-ITS区进行扩增、序列分析,明确了5个种之间的亲缘关系。Subbotin等扩增了5种胞囊线虫rDNA的28S基因的D3扩展区和ITS1-5.8S-ITS2区,结果发现G.rostochiensis和G.pallidaD3扩展区的核苷酸序列相同,并用RFLP分析成功区分了来自南美茄科植物上的3种胞囊线虫G.rostochiensis、G.tabacum、G.pallida和1个未描述的种,同时构建了遗传上亲缘关系的系统树。Zouhar等用PCR扩增技术,经RFLP、RAPD、SSCP分析成功区分了来自捷克的5个G.rostochiensis群体和3个G.pallida群体。2.7pcr扩增d.dipsaci产物的生物活性鳞球茎茎线虫(D.dipsaci)、马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)和食菌茎线虫(D.myceliophagus)是重要的植物寄生线虫,在分类鉴定上比较困难。Wendt等用保守性通用引物rDNA1和rDNA2从D.myceliophagus和D.dipsaci中扩增出约900bp的DNA片段,从D.destructor中扩增出约1200bp的ITS产物。Zouhar等用通用引物扩增D.dipsaci的ITS区(引物是由Caenorhabditis