辣椒抗病基因同源序列的构建

辣椒抗病基因同源序列的构建

0nbs-lrr类抗病基因【研究意义】青椒是世界上广泛种植的园艺作物，但由于各种疾病的影响，每年都会造成巨大的青椒产量损失。随着分子生物学的深入研究，分离克隆辣椒抗病基因对了解病害的发生机制、植物抗病分子机理有着非常重要的作用，可为有效控制病害的发生和抗性育种打下坚实的理论基础。【前人研究进展】当前克隆到的大量植物抗病基因，根据其序列特征可分为5类，其中编码含有核苷酸结合区和富含亮氨酸重复区（nucleotide-bindingsites-leucine-richrepeat,NBS-LRR）结构域的蛋白质抗病基因是其中最大的一类，约占总数的75%。NBS-LRR类抗病基因广泛存在于植物中，如拟南芥中大约含有150个，水稻基因组中含有600多个，这些基因通常在染色体上成簇出现。NBS区被认为是许多蛋白质执行功能的必需元件，与ATP和GTP的结合有关，而且它还具有激酶活性，可以激活其它功能蛋白。LRR结构域则可能在蛋白质的相互作用中起重要作用，参与抗病反应的识别及识别后的抗病信号传导。NBS-LRR类抗病基因含有一些高度保守的结构域，如kinase-1a区（即P-loop区）、kinase-2区、kinase-3a、GLPL区等。根据这些保守结构域设计特异性的简并引物，以植物基因组DNA为模板进行PCR扩增，就可得到抗病基因的同源序列（RGA）。人们已利用这种方法在多种植物上克隆及定位了许多RGA。黄代军等从柚的cDNA中获得10个抗病基因同源序列，与已知抗病基因的氨基酸序列的同源性为11.5%～47.1%；Soriano等从杏树中扩增出6类RGA，并开发了27个AFLP-RGA的分子标记，其中16个标记用于构建杏树的遗传图谱；王海燕等根据NBS-LRR保守区设计两对引物，采用RT-PCR方法从小麦中得到3个抗病基因同源片段，Northern杂交分析表明，它们在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【本研究切入点】经典的植物抗病基因的克隆方法大多采用图位克隆和转座子标签法，如已克隆的拟南芥的RPS2基因，烟草的N基因等。自1995年人们发现已克隆的抗病基因存在一些相似的结构后，就开展了使用这些保守结构域设计简并引物分离和克隆抗病基因及其同源片段的研究。但用此方法扩增辣椒RGA的报道还比较少见。【拟解决的关键问题】本文根据已知抗病基因的保守结构域设计简并引物，在辣椒品系PR205的基因组DNA中分离抗病基因同源片段，并分析这些序列的同源关系，为辣椒抗病基因的分离和鉴定奠定基础。1材料和方法1.1材料表面供试材料为抗根结线虫、蚜虫的辣椒品系PR205，本实验室保存。1.2方法1.2.1基因i2c-1及拟南瞳霉病基因的构建根据番茄抗根结线虫基因Mi-1.2、细菌性斑点病prf、抗孢囊线虫基因Hero、抗萎蔫病基因I2C-1及拟南芥抗霜霉病基因RPM1的NBS-LRR保守区域kinase-1a区（GVGKTT）和GLPL区（GLPLAL）的核酸序列特征，运用Primer5软件设计一对简并引物，即由上海生工生物工程有限公司合成。1.2.2dna提取采集辣椒PR205的新鲜嫩叶，参照Fulton等的CTAB小量法提取基因组DNA。1.2.4ra图2PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶检测，利用凝胶回收试剂盒（上海生工）回收目的片段，克隆至pMD18-T载体（TaKaRa）中。16℃连接3h,4℃保存过夜。取5µl连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布于含有Amp/IPTG/X-gal的LB固体培养基平板上，37℃培养过夜，挑选白斑若干，于含Amp50mg·L-1的液体LB培养基，37℃200r/min振荡培养过夜，利用M13通用引物进行PCR扩增，以确认T载体中插入片段的有无及长度大小。1.2.5功能域分析序列分析首先使用NCBI的VecScreen程序去除测序片段中的载体序列，再使用BLAST搜索同源序列，然后结合NCBI的ORFfinder程序搜索开放阅读框，并用pfam(http：///）进行功能域分析。进一步用ClustalX(1.81）软件对候选基因片段进行多序列比对，并构建系统聚类图。2结果与分析2.1对白蛋白重组子的检测利用简并引物DP1和DP2，以辣椒PR205基因组DNA为模板，PCR扩增，获得1条500bp左右的片段（图1），这与所用引物预期的扩增片段大小一致。目的片段经回收、克隆，得到大量白斑重组子。随机挑选其中的50个白斑重组子，摇菌，进行PCR检测，鉴定插入T载体中的片段及其长度。结果获得了44个阳性重组子（部分结果见图2），并按顺序从1～44号进行编号。2.2抗烟草花叶病基因的聚类分析随机挑选其中35个阳性克隆进行测序。结果表明，有25条序列具有完整开放读码框和NBS-LRR功能域，初步确认这25条序列为RGAs。其它测序序列或含有多个终止子，或只存在两条引物序列中的一条，或与RGAs序列特征相差太远，故下面的分析中将不再予以涉及。通过BLAST比对发现，这些序列与已知的抗病基因都有一定的关联，如Mi、Hero、prf、I2C-1等。利用ClustalX(1.81）软件对这25条具有连续ORF的氨基酸序列与已知抗病基因Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1、M（亚麻抗叶锈病基因）、N（烟草抗烟草花叶病毒基因）的相应区域进行聚类分析。根据序列的相似性及聚类分析结果（图3）将这些氨基酸序列分为两大类：Ⅰ和Ⅱ。在第Ⅰ类中，只有基因M和N聚在一起，它们都属于TIR-NBS-LRR类抗病基因；其余已知抗病基因及所有RGA均聚在第Ⅱ类中，它们则属于non-TIR-NBS-LRR类抗病基因，而这些RGA又可以分为7个亚类（RGAⅠ～RGAⅦ），其中p12,p33,p1,p8,p11,p4,p35,p22,p6,p20,p32,p18和Mi-1.2聚为一类（RGAI）;p28,p21,p26,p9聚为一类(RGAII)；p23,p15,p29,p2和Hero聚为一类（RGAⅢ），25条辣椒RGA大部分都聚在这3类中。而且，亚类RGAⅡ、RGAⅣ、RGAⅤ和RGAⅦ没有所选的已知抗病基因与其聚在一起，可能与用于聚类的抗病基因较少有关，也可能因为它们属于新的抗病基因类型。由图3还可看出，p20与Mi-1.2,p30和prf的遗传距离非常小，说明p20和p30可能分别为Mi-1.2、prf基因的一部分或这两个基因的同源片段。2.3各基因相似性分析根据进化树分析结果和核苷酸多态性，在辣椒7个RGA的亚类中，各选取一个居中的克隆（p35,p21,p29,p19,p10,p30,p25）作为代表进行氨基酸序列相似性比较分析。利用DNAMAN软件的多序列比对分析得到表1。这7类RGA之间及与已知抗病基因相应区域的氨基酸序列的相似性为27.4%（RGAⅥ和RPM1）到98.2%（RGAⅥ和prf）。这7类RGA与Mi-1.2相应区域氨基酸相似性为40.4%～90.4%；与I2C-1相应区域氨基酸相似性为31.3%～40.6%；与prf相应区域氨基酸相似性为32.7%～98.2%；与RPM1相应区域氨基酸相似性为27.4%～33.5%；与Hero相应区域氨基酸相似性为31.1%～94.6%。2.4关于实验型辣椒抗根结线虫基因的同源性如图4所示，p20与Mi-1.2核苷酸比较发现，只有在p20的第284位和第413位两处的核苷酸与Mi-1.2不同，这可能是由于PCR扩增时发生错配或是测序误差所致。经氨基酸比对发现两者的同源性达99%，这说明在辣椒PR205中含有与番茄抗根结线虫基因Mi-1.2同源性很高的基因，p20可能就是辣椒抗根结线虫基因的一部分，这为辣椒抗根结线虫基因的克隆提供了序列依据和理论支持。同样，p30与prf进行序列比对发现其核苷酸同源性为98%，氨基酸的同源性为99%，说明在该辣椒品种中也含有与prf同源的基因或p30就为prf抗病基因的一部分。3rga的扩增、序列及序列分析在各种植物中，NBS结构域都是高度保守的，这为利用同源序列法分离和克隆抗病基因同源片段提供了一条方便、快捷、简单的途径。使用简并引物进行PCR扩增RGA的策略已在多种植物中取得成功。如大豆、甜菜、棉花、高粱和玉米等。扩增这些RGA的主要目的是分离植物抗病基因或作为分子标记辅助抗病育种。RGA与R基因主要有以下几种关系：（1)RGA是R基因的一部分。Bendahmane等以马铃薯为材料，发现其中一类RGA与抗X病毒基因Rx2紧密连锁，并被证明为该基因的一部分。（2)RGA与R基因紧密连锁。Donald等根据RGA序列开发的一个650bp的CAPS(cleavedamplifiedpolymorphicsequence）标记和一个850bp的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregion）标记。此SCAR标记与葡萄的灰霉病抗性位点共分离。（3)RGA与R基因无关。有些RGA与已知的R基因未能表现连锁或相关关系，这类RGA可能并非是真正的抗病基因，也可能是未发现的新的抗病基因。本文也用此方法在辣椒PR205中成功地分离到25个抗病基因同源片段，而且这些RGA的序列都与已知的抗病基因或其它物种的RGA有密切关系。因此，它们中的某些RGA很有可能编码一些未知抗病基因的产物。本试验中获得的25个辣椒RGA的氨基酸序列之间表现了广泛的相似性，系统进化树分析将其分为7个不同的类别。除RGAⅠ、RGAⅡ、RGAⅢ外，其余类别只含有1个或2个成员，这说明在辣椒基因组中RGA的丰富度存在一定的差异性。在图3中明显看出p30与prf基因、p20与Mi基因的遗传距离非常小。经序列比对分析，p30与prf基因的核苷酸相似性达98%、氨基酸的相似性达99%，推断p30可能是prf基因的一部分或同属于一个基因家族；p20与Mi-1.2基因的核苷酸、氨基酸的相似性都达到了99%，推断p20为Mi基因的一部分。根据p20的序列信息，陈儒钢等利用RACE技术在辣椒PR205中克隆出高抗南方根结线虫的基因CaMi(GenBank登陆号：DQ465825）。该基因全长5351bp，含有2个内含子，大小分别为1297bp和72bp,mRNA长3986bp，其中5′非编码区为86bp,3′非编码区为126bp,CDS长3774bp，编码1257个氨基酸。根据NBS-LRR抗病基因蛋白质的N端是否含有果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体（tollandinterleukin-1receptor,TIR）可将其划分为两个亚类：TIR类和non-TIR类。TIR和non-TIR类蛋白在NBS区存在明显的差异：RNBS-A-TIR(LQKKLLSKLL）和RNBS-D-TIR(FLHIACFF）只特异地存在于TIR类抗病基因中，而RNBS-A-nonTIR(FDLxAWVCVSQxF）和RNBS-D-nonTIR(CFLYCALFPED）则专一地存在于non-TIR中。此外，NBSKinase-2区的最后一个氨基酸也可以用来区分这两类抗病基因：当此位点的氨基酸是色氨酸（W）时即归为non-TIR类；是天门冬氨酸（D）时则归为TIR类抗病基因，其准确度可达95%。笔者的研究结果显示，用于聚类的所有序列明显地分为两类：TIR类和non-TIR类。其中这25条辣椒RGA的编码产物均为non-TIR类抗病相关蛋白，这可能与笔者用于设计引物的抗病基因序列信息均属于这一类型有关，也可能是由于辣椒中的non-TIR类型的RGA含量比较丰富。4基于同源基因文库建立了新的合成系统基因分子身份证mif-pcr检测根据已知植物抗病基因的保守结构域设计简并引物DP1、DP2，在辣椒品系PR205中扩增得到25个RGA。经过聚类分析及同源性比较，发现这25条RGA与已知的植物抗病基因都有一定的关系，并确认p20是辣椒抗根结线虫基因的一部分，即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。这些研究结果为辣椒抗病基因的分离和克隆提供了条件，同时也说明利用同源序列法克隆辣椒