地中海贫血基因突变1例

地中海贫血基因突变1例

iv地中海出血是指完全受环境影响的珠蛋白链合成部分或严重受限制的红细胞疾病。这是世界上最常见的隐性遗传因素之一。这种临床表现为慢性进行性溶血性贫血的单基因遗传病多由β珠蛋白基因点突变所致,少数为基因片段缺失。β-地中海贫血在地中海、中东、亚洲、印度地区和远东的人群中流行,亚洲东南部是发病率最高的地区之一。目前为止,世界上明确了超过200种致病突变。临床工作中,对β地中海贫血基因突变类型中的8个常见位点[TATAbox-29,TATAbox-28,CDl7,CD41-42,CD43,CD26(HbE),CD71/72,IVS2nt654]和9个少见突变位点(TATAbox-32,TATAbox-30,Cap+40-+43,IVSInt,CD14-15,CD27/28,IVSl-1,IVSl-5,CD31)的检测能基本诊断出绝大多数β地中海贫血。本研究报道1种新的罕见β地中海贫血突变类型,即位于β珠蛋白exon1的CD27(GCC-GAC)突变。1材料和方法1.1血清学检测先证者,女,3岁。因面色苍黄2年余入院。体格检查呈重度贫血貌,皮肤黏膜轻度黄染,巩膜稍黄染。肝右肋下6cm,脾大,甲乙线7cm,甲丙线8cm,丁戊线0cm。患儿多次于外院住院诊疗未能确诊。先证者父亲32岁,湖南人,体检未发现异常;母亲32岁,湖北人,体检未发现异常。1.2血红蛋白电泳及定量分析红细胞指数分析采用Sysmexxs-1000i血细胞分析仪(Sysmex公司)。血红蛋白电泳及定量分析采用Rep全自动快速电泳分析系统。抽取静脉血2mL置于EDTA-K2抗凝管中,颠倒摇匀,按仪器及试剂使用手册要求进行检测。1.3土地产生的基因取外周静脉血,用酚/氯仿抽提法提取先证者及其父母血白细胞中的基因组DNA,采用Gap-PCR试剂盒(深圳益生堂公司)检测中国人群常见的3种α地中海贫血基因类型:-α3.7、-α4.2和-SEA。采用反向点杂交法试剂盒(深圳益生堂公司)检测17个已知β-地中海贫血基因突变位点,包括8个常见突变位点及9个少见突变位点。1.4er双脱氧末端终止测序法采用PCR扩增获得β-珠蛋白基因全序列,用Sanger双脱氧末端终止测序法对先证者及其父母的DNA进行直接序列测定。参考序列的GenBank,号为NG_OOOOO7.3。序列比对采用DNASTAR软件。2结果2.1网织红细胞及外周血正常组织形态该家系3个成员红细胞指数和血红蛋白电泳分析结果见表1。先证者父母的各项指标均处于正常范围,没有地中海贫血的血液学表现。先证者具有典型的小细胞低色素贫血,外周血涂片细胞形态为:红细胞大小不等,部分红细胞淡染区扩大,其他畸形红细胞不多见。网织红细胞比率34.91%,绝对值0.513×1012/L,未成熟网织红细胞15.6%。白细胞及血小板处于正常范围。血红蛋白电泳HbF升高,为5.8%,HbA2正常。红细胞脆性检查:开始溶血4.4g/L,完全溶血3.2g/L,提示脆性正常。2.2地中海血液基因的突变分析此家系3个成员(先证者、母亲、父亲)中,均未发现中国人群中3种常见的α地中海贫血突变及17种β地中海贫血突变。2.3cd27标准编码氨基酸先证者β珠蛋白基因的测序结果显示,测序样本在CD2、CD27有双峰。其中CD2标准序列为CAT,而先证者为CA(T/C)杂合,相应密码子编码的氨基酸没有变化,均为组氨酸,推测该种变化仅为一种多态性,与β地中海贫血无关;CD27标准序列为GCC,而先证者为G(C/A)C杂合,编码氨基酸由丙氨酸变为天冬氨酸。先证者母亲测序样本在CD2有双峰,为CA(T/C)杂合。先证者父亲测序结果未发现β珠蛋白可能存在的突变基因(图1)。3中间型蛋白表达的鉴定β地中海贫血危险度的临床及血液学表现有3种状态,分别是携带状态、中间型及重型地中海贫血。β地中海贫血携带状态无临床症状,其基因型多为杂合子。重型极度依赖于输血。中间型地中海贫血包括一类临床上和基因型上差异很大的地中海贫血类疾病,症状的严重度从输血依赖型到无症状携带者。中国按病情轻重不同,将β地中海贫血分为重型、轻型和中间型。中间型地中海贫血的特点为:1)发病年龄4～5岁;2)中度贫血Hb60～90g/L;3)轻度肝脾大;4)外周血红细胞呈显著大小不等,异形明显,有核红细胞及网织红细胞增加;5)HbF含量高,HbA2可升高、正常或降低;6)输血量少或不必输血仍可维持生命。本例先证者多次住院期间已完善各种检查排除其他原因引起的溶血性贫血,其血涂片、Hb电泳分析上较符合中间型地中海贫血的特点,但其贫血程度、溶血症状和脾大等体征却相对较重,而常规珠蛋白基因突变检测未发现异常。因此,推测患儿为常规检测的突变以外的基因突变引起的中间型β地中海贫血。本例先证者β珠蛋白基因全长测序发现exon1(第1个外显子)第27位密码子突变,相应位置编码的氨基酸从丙氨酸变为天冬氨酸。已有研究表明,点突变影响β珠蛋白表达的方式有3种:突变导致β基因转录缺陷(启动子和5′UTR突变);突变影响信使RNA(mRNA)加工(剪接点和共有序列突变、poly-A位点、和其他3′UTR突变);突变导致mRNA不正常翻译(无义、移码和起始密码子突变)。根据β链产量降低的程度,β+-地中海贫血突变可分为重型、中间型和沉默型。沉默型突变的特征为:血液学未能发现异常,只能发现α/β珠蛋白链合成率的轻度失衡,由末端CACCC盒、5′UTR、poly-A和一些剪接缺陷引起。中型突变表现出中等的地中海贫血样血液学特征且血红蛋白链合成失衡,由近端CACCC盒、TATA盒、5′UTR、或exon1突变引起。exon1的突变导致另一种剪接(HbMalay、HbE和密码子24T→A),突变可激活exon1一个隐蔽的剪接位点,一般在密码子19、26和27,并与中间型或沉默型有关,由于这种剪接前已进行正常剪接导致异常的HbMalay、HbE(在亚洲东南部尤为常见)和HbKnossos。由此,猜测本例先证者的β地中海贫血表现可能由β珠蛋白的第27位密码子CD27(GCC-GAC)引起,进一步应明确先证者的地中海贫血表现是否由β珠蛋白突变引起,可作β珠蛋白基因表达量的检测;β珠蛋白基因及其蛋白表达之间的连锁分