伴皮质下梗死及白质脑病的ec基因突变多态类型分析

伴皮质下梗死及白质脑病的ec基因突变多态类型分析

皮质下动脉硬化疾病和白质脑病（cd-iii）显示的显性脑动脉疾病的遗传因素非常重视青年脑梗死的审理因素。目前,全世界已经有超过400个相关CADASIL家系报道,大多数为白种人。国内2000年报道了首例家系。本研究通过对4例中国CADASIL先证者及其家系进行NOTCH3基因研究,旨在了解相关热点基因突变区、突变类型,对临床前期患者做出基因诊断,以便了解中国CADASIL患者的自然病程。1对象和方法1.1目标1.1.1性别、年龄及资料系2002～2003年首都医科大学宣武医院神经内科、温州医学院附属医院、山西医科大学附属医院就诊患者,男3例,女1例;年龄38～62岁,平均(45±6.8)岁。临床表现均为反复缺血性卒中发作及血管性痴呆(VD)。有明确家族史,无先兆性偏头痛发作,无高血压、糖尿病、高脂血症、血管淀粉样变性病史;否认吸烟、饮酒史。1.1.2前证是党证,先证即证共14人,男9人,女5人;年龄29～48岁,平均(34±6.8)岁。6人来自家系1,与先证者有血缘关系5人,其中3人(Ⅲ1、Ⅲ7、Ⅲ13)有缺血性卒中发作史,但无VD,2人(Ⅲ2、Ⅲ3)无临床症状;1人无血缘关系(Ⅱ1)。7人来自家系2,6人与先证者有血缘关系,其中5人(Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅱ10、Ⅲ2、Ⅲ8)有与先证者相似的临床表现,1人(Ⅲ7)无临床症状;1人无血缘关系(Ⅱ14)。1人来自家系3,与先证者有血缘关系(Ⅱ7),但无先证者相似的临床表现。家系1～3谱图见图1。家系4未提供家系资料。1.1.3不同性别学生的健康查体系同期在首都医科大学宣武医院参加流行病学调查研究的健康查体者100名,男52名,女48名;年龄56～72岁,平均(63±8.2)岁。无神经系统变性病史及精神病史,无脑血管病高危险因素及家族史。1.2方法1.2.1提取的dna入组者知情同意后,取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝),4℃保存,两周内采用《分子克隆》第二版介绍的方法从血液白细胞中提取DNA。1.2.2pcr扩增条件(1)采用聚合酶链反应(PCR)体系:总反应体积为25μl[去离子水18.7μl,Mg2+缓冲液(15mmol/L)2.5μl,dNTP(2.5mmol/L)2μl,引物F0.5μl,引物R0.5μl,模板DNA0.5μl及Taq酶0.3μl;引物序列见表1,其中第3、4、18、20外显子引物序列引用相关文献,余引物序列均为使用oligo及DNAstar软件自行设计。(2)PCR扩增的热循环条件如下:95℃预变性5min;95℃,30s,[第2外显子(60℃,45s);第3外显子(57℃,45s);第4外显子(58℃,45s);第5～22外显子(60℃,45s);第23外显子(59℃,45s)],72℃,70s,35个循环;72℃延伸10min。(3)取5μlPCR产物加入0.5μl上样缓冲液,进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,电压为120V,30min后观察结果,出现相应长度的单一PCR扩增条带,认为扩增成功,待变性高压液相色谱分析(DHPLC)检测。(4)DHPLC检测条件:2～3μl的PCR产物被流动相为0.9ml/min的速度带至DNA分离柱而得以分离,分析一个样品需要8～10min。对经DHPLC检测为单峰的PCR产物调整柱温,调整范围在1～3℃,以观察峰形变化。分别选取CADASIL组及正常对照组突变峰型及正常单峰进行二次PCR扩增,送至上海生工生物工程技术服务有限公司,使用美国ABI公司377机型进行双向测序,确定致病性突变、多态及野生型基因序列。2结果2.1外显子3、4突变见表2及图2～4。4例先证者及其家系中共发现3种致病性突变,分别位于外显子3及4中。家系2中所有发病者及1名未发病者出现与先证者相同的基因突变。家系1中所有发病者及1名未发病者出现与先证者相同的基因突变。2.2骨葬的先证人及其家人系统的成员非物质遗传因素的多态性类型见表3。4例先证者及其家系中共发现NOTCH3基因15种多态类型。3cadasil基因检测1977年Sourander等首先报道了1个CADASIL家族,称之为遗传性多梗死性痴呆;1993年Tournier-Lasserve等将致病基因定位于19号常染色体;1996年进一步定位为NOTCH3基因。NOTCH3基因编码含有2321个氨基酸的跨膜受体蛋白,其细胞外区包含34个表皮样生长因子重复序列(EGF-like),每个EGF-like包含6个高度保守的半胱氨酸残基,并形成3个二硫键。正常组织中,NOTCH3基因的表达严格限于血管平滑肌细胞。NOTCH3基因致病性突变导致EGF序列半胱氨酸残基数量的奇数化,破坏了规范的二硫键的配对,导致血管平滑肌细胞功能异常而致病。CADASIL是系统性动脉疾病,但首先表现为脑部症状,其病理生理基础主要依赖于一些特殊的脑血管构筑特征和循环模式。血管平滑肌细胞在维持脑部穿通动脉灌注区域的灌注压和脑血流自身调节中起着重要作用,故患者头颅影像学改变多为穿通动脉供血区的腔隙性梗死。本研究中家系1～3先证者头颅磁共振检查显示多发皮质下梗死,家系2先证者同时伴有脑桥梗死,均为长穿通动脉供血区。CADASIL作为卒中、痴呆、偏头痛、癫癎的病因,其诊断标准为:(1)中年起病,有反复脑缺血发作史,多伴有认知功能障碍及偏头痛发作史;(2)具有家族遗传性;(3)头颅影像学检查显示多灶性皮质下梗死及白质脑病;(4)电镜下发现小动脉中层平滑肌细胞表面存在嗜锇颗粒物质(GOM)沉积;(5)NOTCH3基因检测可发现致病性突变。其中病理改变和基因检测为诊断的金指标,其余均缺乏特异性。临床常见的线粒体脑肌病、家族性白质脑病、Bingswanger病仅从临床表现及影像学改变,很难与CADASIL进行鉴别。此外,2000年Joutel等报道首例散发的CADASIL患者,并经测序证实患者NOTCH3基因的第4外显子存在致病性错义突变。对于散发的多发性梗死痴呆患者,即使没有明确的家族史也应考虑本病的可能性,由此可见家族遗传史也不是诊断CADASIL的必备条件。病理活检为有创伤性检查,患者接受程度差,且相关转基因小鼠实验表明,特异性小动脉中层平滑肌细胞表面GOM沉积仅在疾病晚期才出现,对临床早期及临床前期患者诊断意义较低。故与CADASIL表现相似的疾病鉴别时,NOTCH3基因突变检测成为主要鉴别点,是目前从分子水平上诊断CADASIL的重要指标。本研究共检测出3种突变类型(90Arg→Cys,134Cys→Tyr,141Arg→Cys),与国外同类研究结果一致,分别造成膜外区第2、3EGF-like区Cys数量的奇数化,均为杂合错义突变,其中一种为高度保守的Cys被Tyr替换,另外一种为Cys替代Arg。Cys134Tyr突变类型目前国内尚无报道。上述3种突变类型均未在正常对照组中发现。所发现的NOTCH3基因致病性突变均存在于第3、第4外显子,国内王朝霞等进行相关CADASIL家系基因突变研究,共发现4种NOTCH3基因的突变类型,其中3种存在于第3外显子,1种存在于第11外显子。结合本研究结果,提示第3、第4外显子亦可能是中国CADASIL患者的热点突变区。建议在对中国CADASIL患者进行基因检测时,首先检测上述两个突变位点,如未发现致病性突变,再进行其他的外显子检测。本研究同时发现多个多态类型,突变发生在内含子区及外显子区,但均未造成Cys残基数量的改变,多为同义突变,故无临床意义。CADASIL的自然病程多为30岁出现伴有先兆的偏头痛,10年后出现首次卒中发作,20～30年后出现皮质下痴呆,病程多为20～30年。CADASIL的整个病程是千变万化的,即使在同一个家系,病程的表现差异也很大,所以对家庭成员进行早期基因检测,可及时发现临床前期的患者。本研究对CADASIL家系1及家系2先证者的一级亲属进行相同位点基因检测,发现了2例临床前期患者(见家系谱图所示家系1Ⅲ3及家系2Ⅲ7),具有与先证者相同基因位点突变,但无相应的临床症