乳酸菌黏附上皮细胞作用机制的研究进展

乳酸菌黏附上皮细胞作用机制的研究进展

现在，由于大量使用和滥用抗生素，动物肠道菌群严重失衡，出现了大量几种抗药菌，动物体对各种疾病的抵抗力降低，混合疾病增多，治疗难度增加。同时,因抗生素的大量应用,造成畜产品的残留增加、环境的污染。因而,抗生素等药物的大量应用造成的弊端已成为畜牧业可持续发展的一个严峻的问题。双歧杆菌、乳酸杆菌等益生素菌株的分离成功,使我们对于抗生素问题的解决充满了希望,大量的试验结果表明,双歧杆菌、乳酸菌对动物体具有免疫增强、营养、抗御病原体的侵害等作用。这些有益菌的主要作用原理一是通过粘附抗性、竞争排斥和免疫调节功能,限制有害菌体在体内定植;二是通过分泌一些细菌素、氨基酸、维生素、酶类等产物帮助宿主消化和抑制有害菌生长。目前,有关正常菌群在肠道的种类、数量及应用效果的研究较多,而对于有益菌群与肠道粘膜的粘附和定植的机制和影响因素研究较少。本文对目前国内外有关消化道乳酸菌的粘附机制及其影响因素方面的研究情况进行综述,以期对乳酸菌等有益菌的合理开发利用提供新的思路和理论依据。1共同语言理论1.1乳酸菌的粘连特性过去许多学者认为,益生乳酸菌的粘附具有宿主特异性,而宿主特异性被认为是益生菌的特有性质,因而被作为选择益生素的标准之一。而又有报道,乳酸菌的粘附特性,并不具有宿主特异性,而是其自身的菌系特异性(RinkinenmM,2003;GusilsC,2002),乳酸菌的粘附特性主要是乳酸菌菌株的独自特性,粘附性好的菌株对许多宿主来说都具有很好的粘附作用。宿主特异性学说认为,宿主肠道上皮细胞上可能具有某种不同物质与乳酸菌的粘附有关,粘附物质多少与粘附程度有关。而非特异性学说认为在动物生产中选择益生乳酸菌菌株时首先要考虑高粘附性问题,不同菌株表面物质不同,因而与肠道上皮细胞粘附程度不同。李平兰等(2002)研究表明,来自猪和人类粪便的不同种类乳酸菌在体外与人结肠癌细胞系HT-29细胞的粘附能力不同,其中双歧杆菌的粘附能力最高,平均在10.5个菌/细胞;乳杆菌的粘附能力较低,平均在3.2个菌/细胞;球菌的粘附能力很低,平均在2.3个菌/细胞,其中双歧杆菌中的Bifidobacterium.bifidumO2菌株粘附能力最好,达到18.4±2.7个菌/细胞。乳杆菌中Lactobacillusacidophilus99101菌株粘附能力最好,达到10.2±1.8个菌/细胞,同时,同种不同株的乳酸菌粘附能力有差异,而同属中来自人粪便和来自猪粪便的乳酸菌的粘附能力没有明显差异。今后的研究工作应该从两方面着手,一是研究消化道不同部位的不同的粘附物质;二是筛选与肠道粘附因子相结合的特异的高粘附性的乳酸菌菌种。1.2宿主表面可能是受体随着研究的不断深入,科学家从分子水平角度逐渐发现,粘附作用主要是乳酸菌体表面一些特定的分子如LTA(脂磷壁酸)、PSC(多糖)和粘附素蛋白等识别宿主表面特异的受体的结果。而宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂有可能就是受体,可有选择性地吸附特定种类的细菌,没有被吸附的菌体被流体带到不利于其生长的环境中去。乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合,在肠粘膜表面定植占位,是形成生理屏障的主要组成部分,如果这个屏障遭到抗生素或其它因素的破坏,宿主便失去了对外来菌的抵抗力,就不能抵御外来菌的入侵或者会使具有耐性的肠内菌异常增殖而取代优势菌的位置,造成肠道内微生态平衡的失调。1.2.1组织形态功能肠道粘膜上皮细胞,包括粘膜上皮细胞、杯状细胞(可形成三叶状蛋白,通过聚合粘性糖蛋白来保护上皮细胞免受外部损害,从而加强宿主防御)、潘氏细胞、未分化细胞和内分泌细胞,还有特异性的上皮细胞,如滤泡相关上皮细胞、膜上皮细胞、肠粘膜上皮细胞数量居多,核呈卵圆形,顶部有大量线粒体,胞质内有丰富溶酶体、微管、微泡系统发达,细胞纹状缘由致密微绒毛、肠上皮细胞间以紧密连接为主,刷状缘表面分布致密的糖萼(糖衣)和碱性磷酸酶,它们与分泌型SIgA、杯状上皮细胞分泌的粘液组成机体与外界的一层屏障,阻止绝大部分外来食物致病原的侵入。SannaEdelman等(2002)通过体外研究乳酸杆菌系对鸡消化系统细胞和组织类型以及回肠粘液的粘附作用结果表明,乳酸杆菌粘附至嗉囊的上皮细胞上去,粘附到上皮的小囊滤泡以及成熟的肠道细胞的长柔毛顶端,而未粘附到未分化肠细胞表面如生产粘膜的杯状细胞或者回肠粘液表面。BernetMF等(1994)用嗜酸乳杆菌(Lbacidophilus)LA1株与肠致病菌一起同人结肠癌细胞系CaCo-2(相当于肠上皮细胞)共同培养,发现肠致病菌的粘附能力受抑制,这可能是乳杆菌细胞与致病菌细胞之间存在的非特异性的对肠上皮细胞顶端受体的空间位阻现象引起的。MackDR(1999)研究提出乳酸菌可以通过改变肠道粘液成分抑制致病菌的粘附,肠道上皮组织细胞分泌的粘液覆盖于肠道表面,其重要成分就是大分子的粘蛋白(含有长碳水化合物链,通过O-糖苷键连接N-乙酰半乳糖胺和肽骨架上的苏氨酸或丝氨酸),粘蛋白Muc2和Muc3是回结肠粘液中的优势蛋白。他们在体外实验中发现植物乳杆菌299V和鼠李糖乳杆菌GG能有效地抑制病原性大肠杆菌与肠上皮细胞系HT-29的粘附,但不能抑制其与肠上皮细胞系HeP-2的粘附作用;而在HeP-2细胞系中加入富含粘蛋白Muc2和Muc3的培养基,这两种菌株就能够抑制肠致病菌与HeP-2细胞的粘附,当用植物乳杆菌299V与HT-29细胞系,共培养发现粘蛋白Muc2和Muc3的mRNA表达水平提高。表明了这两株菌对病原菌的粘附抗性是通过提高肠道粘蛋白Muc2、Muc3表达来实现的。双岐杆菌粘附与肠道粘膜糖蛋白有关。邓一平等(2000)用猪胃粘膜糖蛋白与双岐杆菌及表面分子作用表明,双岐杆菌在体内定植和粘附与其表面分子LTA(脂磷壁酸)、WPG(完整肽聚糖)、PS(多糖)有关。起主要作用的为LTA与WPG,它们与胃粘膜糖蛋白粘附性强。FountainLF等(1994)用ELISA方法检测了分叉双岐杆菌对大鼠肠粘膜提取的粘附素在体外的粘附作用,效果较好。双歧杆菌的黏附素是一种不耐热的蛋白质,肠上皮细胞上黏附素受体为糖蛋白,与甘露糖有关(郑跃杰,1997和1999)。由于肠管各区段的粘蛋白成分不同,因此不同肠段粘附的有益菌群的种类和数量不同,这些机理有可能解释为什么不同种动物不同消化道区段粘附和定植的菌株的种类和数量不同。1.2.2双歧杆菌通过蛋白凝胶特性检测细菌组织中的黏附性有关研究者对粘附的分子机制感兴趣,开始对与粘附相关的因子进行研究。、BernetMarie-Francoise等(1993).以CaCo-2细胞(具有小肠微绒毛细胞的某些特性)作为粘附细胞研究双岐杆菌与CaCo-2细胞的粘附机制,电镜观察到粘附发生在CaCo-2细胞的顶端刷状边缘,细菌与顶端微绒毛相互作用,而自身没有被损害,在不依赖Ca2+条件下,整个细菌细胞和培养上清液中的蛋白质类的粘附促进物质,能够促使双岐杆菌粘附到CaCo-2细胞上,而这种蛋白质类的粘附促进物质具有种属特异性。用激光共距式细胞仪研究异硫氰酸荧光素(FITC)标记的双歧杆菌1027株对体外培养的肠上皮细胞的黏附表明,双歧杆菌的黏附素是一种不耐热的蛋白质,由细菌分泌至培养液上清中并且从双歧杆菌1027株上清液中纯化出一种相对分子质量为16,000的蛋白质;光镜及透射电镜观察,双歧杆菌特异性地黏附于LOVO细胞的刷状缘,被黏附的LOVO细胞表面结构无破坏(郑跃杰,1997和1999)。GreeneJeffreyd等(1994)研究表明,乳酸菌株LacidophilusBG2FO4和NCFM/N2的粘附作用能够被蛋白酶所降低,而乳酸菌株LgasseriADH经蛋白酶处理其粘附能力或者没有被影响,或者被提高,乳酸杆菌物种对人类肠道细胞的粘附机制与细胞表面不同的碳水化合物或蛋白因素都有关系,其中乳酸菌株BG2FO4分泌的桥蛋白可能是首要介导的粘附物质。GusilsC等(1999)用鸡的乳酸菌分离的类似凝集素的蛋白碎片来研究探讨其粘附肠道上皮的机制,发现有些种类乳酸杆菌能够凝集甲戊二醛和甘氨酸处理的酵母细胞,而用0.2m甘露糖处理时却抑制这种凝集反应。有些菌株能够凝集鸡红细胞,不凝集人的红细胞,而对其它动物的红细胞的凝集能力不同。利用电泳技术分析这种凝集素分子量约为50～67kDa。若用脂酶处理,在pH6～7、Ca2+浓度为2mM、Mg2+2mM和37～42℃条件下,能非特异性地增加酵母菌凝集和血凝试验。Dunne等(1999)用蛋白酶处理了唾液乳杆菌ucc118株后,SDS检测发现细胞壁表面蛋白中两个分子(195kD和83kD)被降解,Western-blotting测定证实,195kD蛋白与粘附性相关,因此细菌与肠上皮的细胞的粘附可能通过表面蛋白的配体受体识别结合。在鸡的三个种属乳酸杆菌中检测粘附决定因素时认为,细菌的粘附主要受静电作用、疏水空间力、脂磷壁酸和特殊的结构(外在的凝集素和胞外多聚体)的影响,乳酸杆菌株(L.fermentum和L.fermentum.ssp.cellobiosus)细胞表面具有类似凝集素的蛋白质结构,而乳酸菌株fermentumsspcellobiosus表面具有高度疏水作用,而只有动物乳酸菌表面具有核糖醇,磷壁酸(GusilsC等,2002)。Nousiainenandsetala(1998)研究结果也表明,乳酸杆菌利用胞外物质如多糖、蛋白质、脂类和脂磷壁酸可粘附到肠壁上。不同菌株的细胞壁中多糖浓度不同,菌株L.fermentum.ssp.cellobiosus细胞壁中多糖浓度最高,而从乳酸杆菌中提取的凝集素不具有糖残基,表明不同菌系表面结构中都具有类似蛋白质的物质存在。乳酸杆菌具有不同的表面分子,这些表面分子能够使乳酸杆菌和肠道上皮细胞作用。2影响微生物复制和繁殖的因素2.1酸性ph环境对乳酸杆菌溶液溶液溶液流变性的影响GreeneJeffreyd等(1994)研究指出在菌株培养上清液中的小分子量热稳定性的非蛋白因子——酸性pH环境对乳酸杆菌粘附人CaCo-2细胞的效果有影响,能够改变CaCo-2细胞本身,使乳酸杆菌对其粘附性增强。2.2钙独立系统Kleeman和Klaenhammer(1982)研究发现肠道乳酸菌的粘附有两种不同的机理,一种是需要钙的非特异性系统,另一种是钙独立系统。钙独立系统中有两种乳酸菌成分参与了乳酸菌的粘附,一种成分是抗蛋白酶(与菌体表面有关),另一种是热稳定的胞外蛋白,该蛋白对蛋白酶敏感。叶桂安等(1997)在比较双歧杆菌和致病菌对体外肠上皮细胞LOVO细胞株黏附的钙信号传递差异研究中发现,双歧杆菌黏附能引起LOVO细胞内钙离子随时间延长而梯度升高,这主要是源于细胞外Ca2+内流,可能是其作为生理性细菌与肠上皮细胞和谐共生的信号传递基础。2.3对肠道黏膜的黏附菌株伦永志等(2000和2003)观察灭活的青春双歧杆菌DM8504菌株对人大肠癌细胞系CCL-229的黏附时发现,灭活的双歧杆菌可能具有与活菌相同的生态效应;并且灭活的该菌株对肠致病性大肠艾希菌(EP