蓖麻提取物对南方根结线虫病的杀线活性及防治研究

蓖麻提取物对南方根结线虫病的杀线活性及防治研究

根结线虫是一个重要的植物致病性因素，其寄生范围广泛，包括谷物、油出版物、纤维、蔬菜、材料和花卉。根结线虫通常会造成严重的经济损失。通常有四种类型：南方根结线虫、爪哇根结线虫、水生根结线虫和北方根结线虫。根结线虫在中国南方的广泛出现，严重影响了蔬菜生产。目前，化学预防仍然是控制植物寄生昆虫疾病最重要的措施。然而，化学品具有毒性高、残留高、成本高、易污染环境、环境相容性差等问题。天然寄生虫植物具有快速分解、低残留、少污染、少毒性等特点。因此，植物起源活性物质的利用将引起人们的注意。蓖麻(Ricinuscommunus)属大戟科蓖麻属,为双子叶一年生或多年生植物.蓖麻是具有特殊工业用途的油料植物,是集多种开发功能于一体的生物资源,也是一种重要的生物杀虫、抗癌和生物抗污染源.从蓖麻中提取的蓖麻毒素具有较强的杀虫、杀菌作用,是制造生物农药的重要来源.本文以南方根结线虫为研究对象,通过毒力测定及盆栽试验研究了蓖麻提取物的杀线虫活性及防治效果,以期为该病害的生物防治提供参考.1材料和方法1.1供试植株及试剂毒力测试于2010年4—7月在南京农业大学土壤生态实验室进行,盆栽试验于2010年8—10月在南京农业大学土壤生态实验室温室大棚进行.供试蓖麻叶于2009年9月采自山东家祥蓖麻研究所.供试番茄(Lycopersiconesculentum)品种为苏粉八号,由江苏省江蔬种苗科技有限公司生产.供试线虫经鉴定为南方根结线虫.1.2人工繁殖培养在江苏省宜兴市固体有机废弃物资源化高技术重点实验室周边根结线虫危害严重的农田采集土样,接种至番茄苗上进行人工繁殖.从感染根结线虫的番茄病根挑取新鲜卵囊,置于培养皿(d=6cm),皿底垫湿润滤纸1张,置于(25±1)℃培养箱,5~7d后待卵孵化产生大量2龄幼虫时,收集线虫备用.取病根于解剖镜下挑取大小一致的卵囊,用1%的次氯酸钠表面消毒3~4min,无菌水漂洗4~5次,备用.1.3l-1析水提物的制备供试蓖麻先采用微波提取法粗提.然后粗提物采用索氏提取法精提.得到精提物为白色针状结晶.该精提物经核磁共振1H谱结构确定为蓖麻碱(ricinine),测其纯度为89.1%.称取已灭菌的蓖麻叶干粉5g,加无菌水50mL,于30℃振荡浸提24h,1000×g低速离心2min,用无菌滤纸过滤,滤液用无菌水定容至50mL,制成100g·L-1蓖麻水提液.1.4试验设计1.4.1和0.25gl-13参考翁群芳等浸渍法测定提取物对二龄幼虫的毒力.根据预试验的结果,用灭菌水将制备的蓖麻碱溶解稀释成5个浓度梯度:2、1.5、1、0.5和0.25g·L-1;蓖麻水提液稀释成5个浓度梯度:100、50、25、12.5和6.25g·L-1.分别量取3mL稀释液加入d=2.5cm的培养皿(12孔板)中,随后加入50~100条线虫,每处理4个重复,以灭菌水为对照,放置于25℃培养箱中,48h后用针触法镜检线虫死亡数量.按Abbott公式计算校正死亡率,根据浓度对数和死亡机率值,采用最小二乘法求取毒力回归方程,计算LC50.1.4.2评论员ld50在每个培养皿(d=6cm)中放入2个制备好的南方根结线虫的卵囊,处理分别加4mL蓖麻碱稀释液(1g·L-1)和4mL蓖麻水提液(25g·L-1),对照加4mL灭菌水.处理和对照各4次重复.置于25℃培养箱中,分别在2、6、10和14d于解剖镜下观察卵孵化数,并计算蓖麻碱和水提液对卵囊孵化的抑制率.1.4.3植物源农药对照利用根据对二龄幼虫的毒力测定结果,以蓖麻碱稀释液1g·L-1、蓖麻水提液25g·L-1、灭菌蓖麻叶植物粉(与干沙土以1∶150施用)分别为处理组,以灭菌水为溶剂对照,并设0.36%苦参碱水剂(山西省侯马市星火化工厂生产)稀释1000倍为植物源农药对照,辛硫磷(上海爱帮农科技有限公司生产)与干沙土以1∶150施用为常规化学农药对照.采用灭菌土栽培法,将出苗30d后的番茄植株幼苗移栽至装有灭菌土(沙、土比为1∶1)的直径为9cm的塑料杯中,每盆1株,每处理5个重复,置于25℃温室内生长.定植后5d的番茄植株分别接种1000条南方根结线虫二龄幼虫.6d后分别以蓖麻碱稀释液、蓖麻水提液、灭菌水、苦参碱各6mL灌根,以灭菌蓖麻叶植物粉、辛硫磷各1.4g穴施,正常水肥管理,20d后调查试验结果.1.5地上部植株鲜质量常规指标:挖取各处理番茄植株,洗净抹干,将番茄植株平铺,量地上部植株高度及地下部根长度,用电子天平准确称量地上部植株鲜质量.以对照为标准,分别计算:地上部植株株高增长率、地上部植株鲜质量增长率、根长增长率.统计每株根结数,计算根结指数(GI)和根结形成抑制率.生化指标:采用α-萘胺法测定根系活力;采用氮蓝四唑(NBT)法测定叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外吸收法测定过氧化氢酶(CAT)活性.1.6数据处理与分析采用SPSS13.0统计软件进行方差分析Duncan多重比较方差分析,显著性水平设为0.05.图表中数据均用平均值±标准差表示.采用Excel2003软件制图.2结果与分析2.1监测站.4-4-5gl-1和5.毒力测定显示,不同浓度蓖麻碱对南方根结线虫二龄幼虫均有毒杀效果(表1),其毒力回归方程、LC50分别为y=2.1017x-0.8161和0.6g·L-1.随着处理浓度的提高其毒杀效果随之增强.浓度为2和1.5g·L-1的处理,线虫校正死亡率分别达到91.5%和79.4%,均显著高于其他3个处理.浓度为1g·L-1时,校正死亡率为60.1%,且随着浓度的降低毒杀效果显著降低.不同浓度蓖麻水提液对南方根结线虫二龄幼虫的毒杀效果不同(表1),其毒力回归方程、LC50分别为y=1.1412x+3.5588和18.3g·L-1.随着处理浓度的提高其毒杀效果随之增强.浓度为100和50g·L-1的处理,线虫校正死亡率分别为83.5%和64.8%,均显著高于其他3个处理,浓度为25g·L-1时,校正死亡率为52.4%.2.2东南角硅水提液与社会主义碱处理的抑制作用经过2、6、10和14d的观察发现,所有蓖麻碱和蓖麻水提液的处理对南方根结线虫卵孵化都有抑制作用(表2).14d时蓖麻碱抑制作用最明显,抑制率高达61.7%,显著高于蓖麻水提液(49.0%).蓖麻碱和蓖麻水提液处理均在2d时就表现出抑制作用,6d时抑制率出现小幅度下降,10~14d时抑制率出现上升趋势并最终达到最大值.6d时抑制率下降的原因可能是线虫的孵化速率减慢.10~14d抑制率上升可能是由于处理液作用时间较长,导致孵化出的线虫在一定程度上发生死亡分解.2.3提取物对番茄生长和根结的影响2.3.1苦参碱和辛硫磷对南方根结线虫生长指标影响由表3可知,蓖麻提取物对番茄株高、地上部鲜质量及根长的影响相似,均有促进增长作用.其中,蓖麻碱处理的番茄株高、地上部鲜质量及根长的增长率显著大于其他处理.蓖麻碱、蓖麻水提液和蓖麻叶植物粉处理的番茄株高分别比对照增长33.5%、22.6%和15.8%,与对照药剂苦参碱和辛硫磷处理的增长率10.2%和12.3%相比差异显著.蓖麻碱和蓖麻水提液处理的番茄地上部鲜质量分别比对照增长41.4%和18.9%,与对照药剂苦参碱和辛硫磷相比差异显著.蓖麻叶植物粉处理的番茄鲜质量增长率为10.1%,与对照药剂差异不显著.蓖麻碱、蓖麻水提液和蓖麻叶植物粉处理的番茄根长分别比对照增长46.8%、34.5%和33.8%,与对照药剂苦参碱和辛硫磷处理的增长率24.5%和28.1%相比差异显著.线虫为害寄主植物时能分泌特殊物质造成植株形成根结、肿瘤和虫瘿,导致寄主植物发育停滞,矮化或叶片变薄、变黄等.以上试验结果表明,蓖麻提取物3种处理对南方根结线虫有一定的抑制作用,在很大程度上能促进植株的生长.2.3.2根结数及根结指数表3显示,番茄根结数直观地反映了蓖麻提取物对南方根结线虫的控制效果,对照每株根结数多达(37.4±2.3)个,蓖麻提取物各处理植株根结数均显著低于对照.其中,蓖麻碱处理后根结数最少,仅为每株(17.6±1.7)个,与对照药剂苦参碱和辛硫磷处理的每株根结数(25.6±3.4)和(27.4±3.9)个相比差异显著;其次为蓖麻水提液、蓖麻叶植物粉处理,根结数分别为每株(20.6±1.5)和(22.8±3.7)个,与对照相比差异显著.蓖麻碱、蓖麻水提液和蓖麻叶植物粉处理的番茄根结形成抑制率分别比对照增长52.9%、44.9%和39.0%,与对照药剂苦参碱和辛硫磷处理的根结形成抑制率31.6%和26.7%相比差异显著.其中,蓖麻碱处理的根结形成抑制率显著大于其他处理.根结指数可作为作物对根结线虫的抗性及杀线剂药效的评价指标.蓖麻碱处理后根结指数最低,仅为(24.5±5.4),与对照药剂苦参碱和辛硫磷处理的(45.1±12.1)和(51.0±14.4)相比差异显著,且显著低于溶剂对照的(72.4±18.4).说明蓖麻碱处理的植株对根结线虫抗性最大,蓖麻碱的杀线作用最强.蓖麻碱处理与蓖麻水提液及蓖麻叶植物粉处理的(34.1±18.7)和(38.0±5.9)相比差异显著,蓖麻水提液与蓖麻叶植物粉处理之间差异不显著,但均显著低于对照.番茄根结数、根结形成抑制率及根结指数均能客观反映蓖麻提取物对南方根结线虫的控制效果.以上试验结果说明,蓖麻提取物能抑制根结形成,减少植株根结数,防治效果优于商品杀虫剂(苦参碱、辛硫磷).2.3.3根结线虫对根系活力的影响由图1可知,不同处理对番茄植株根系活力的影响不同,蓖麻碱处理的番茄植株根系活力最大,达到121.6μg·g-1·h-1,远大于对照的79.9μg·g-1·h-1,其处理效果最佳,最适合番茄植株根系的生长发育.蓖麻水提液与苦参碱处理、蓖麻叶植物粉与辛硫磷处理的根系活力差异不显著,处理效果接近,但均高于对照.根系活力反映植物根系吸收与代谢能力的强弱,直接影响植株的抗逆性及地上部茎叶的生长和作物产量.由于蓖麻碱处理的根系活力最大,说明该处理下根结线虫对根系的影响最小,其防治效果最好.而对照的根系活力最小,说明该处理下根系对根结线虫的抗性最弱,根结线虫对根系的影响最大.由图2可知,不同处理对番茄植株叶片SOD酶和CAT酶活性的变化趋势相似,处理与对照之间总体呈升高趋势.由于在逆境条件下植物会增加活性氧自由基的清除能力,所以其体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等保护酶会增加,以减轻活性氧对植物的伤害.而对照处理叶片SOD酶活性最大,达到196.5U·g-1,说明在线虫侵染的状态下,植株体内SOD酶增加,以对抗线虫侵染下活性氧的增加.蓖麻碱处理的叶片SOD酶活性相对最小,达到191.5U·g-1,说明蓖麻碱处理中根结线虫对植株的影响最小,植株受害程度最小.其余各处理的叶片SOD酶活性差异不显著,处理效果接近,均低于对照处理,这说明植株受害程度均比对照处理弱.番茄植株叶片CAT酶活性在对照处理达到最大值21.0U·g-1·min-1,蓖麻碱处理为最小值15.0U·g-1·min-1,其他处理CAT酶活性相近,变化幅度较小,差异不显著,但均低于对照处理.该试验中CAT酶在叶片中的活性及含量相对SOD酶弱,但其作用与SOD酶相似,也能间接指示植株在逆境下的抗性及受害程度.3类植物改革剂对南方根结线虫的防治南方根结线虫作为重要的植物害虫,国内外均非常重视寻找合适的高效控制方法,其中印楝(Azadirachtaindica)、乌桕(Sapiumsebiferum)、柠檬桉(Eucalyptuscitriodora)、胡黄连(Picrorhizascrophulariiflora)、鱼腥草(Houttuyniacordata)和夹竹桃(Neriumindicum)等植物源物质对其均有较好的控制作用.有报道,蓖麻碱对天幕毛虫(Malacosomneustriatestacea)、桃蚜(Myzuspersicae)、小菜蛾(Plutellaxyllostella)等3种害虫有不同程度的杀灭作用,蓖麻叶粉碎与肥料混施可以减少根瘤,有效控制根结线虫二龄幼虫.本试验结果表明,蓖麻碱、蓖麻水提液和蓖麻叶植物粉3种物质均对南方根结线虫具有强烈或较强的毒杀活性,而且能显著促进盆栽番茄地上部植株高度、鲜质量和根长生长,显著降低番茄根结数,降低根结指数,对根结形成具有较强的抑制效果,盆栽控制效果良好.根系活力反映植物根系吸收与代谢能力的强弱,直接影响植株的抗逆性及地上部茎叶的生长和作物产量,本试验通过对根系活力的测定可以间接反映不同处理对根结线虫的防治效果.同样,对SOD和CAT两种抗氧化酶的测定可以间接反映在逆境条件下植物的受害情况.苦参碱和辛硫磷是目前农药市场上常用的两种杀线剂.试验发现,与同稀释浓度的苦参碱、辛硫磷相比,蓖麻碱对降低寄主植物根结数的作用效果更优,而蓖麻水提液和蓖麻叶植物粉处理与两种农药的作用效果接近.蓖麻精提物的化学成份为蓖麻碱,其化学名称为3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮,是一种中性生物碱.其分子中含氰基,所以毒