消结灵治疗肝癌的实验研究

消结灵治疗肝癌的实验研究

肝癌是癌症之一，严重危害着健康和生命。全世界每年新发现的肝癌病人约有40万例,据统计在中国发病率为最高,约占42.5%,男性占恶性癌瘤的第3位,女性占第5位,我国每年死于肝癌的患者约10万多人。目前,我国经中西医结合治疗肝癌已取得了显著的疗效,其5年生存率高达36.5%,居世界领先地位。中药消结灵是选用白鲜皮、白附子、牛黄和冬虫夏草等多种纯中药所组成,具有扶正培本、清热解毒、理气化瘀、软坚散结之功效。笔者治疗中晚期肝癌130例。显著改善症状,增强食欲,缓解疼痛,促使癌瘤缩小或消失,提高机体免疫功能,延长生存期,统计总缓解率为72.3%,总有效率为89.2%。笔者建立起多种动物模型,检测消结灵抗癌疗效,采用现代电子显微镜技术和免疫组化染色方法观察超微病理改变,分析和探讨抗癌机理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1监督药片的制备中药消结灵FPSZ0860沈制流字(1995)第43号,由沈阳军区司令部第一干休所门诊部药剂室监制,每片含有效成份250mg。将药片溶掉糖衣皮再研磨成细粉剂,用蒸馏水溶解成不同浓度的悬液温火煮沸10min,粗过滤后备用。1.1.2男性,男性,男性昆明小白鼠,由中国医科大学实验动物部提供,选体重19~21g,雌雄兼用。建立起4种癌瘤模型,每种用小白鼠50只,随机分成对照1组、对照2组(阳性对照)和3个实验组。1.2小鼠移植瘤模型实体型肝癌(HepA)细胞株,由国家医药管理局上海工业研究院药理研究室提供,S180肉瘤细胞株、腹水型肝癌(HAC)艾氏腹水癌(EAC)细胞株,由中国医科大学肿瘤研究所提供。建立实体型HepA和S180模型,将瘤株(1×106)接种在小鼠腋下,使其长成移植瘤。接种24h后,将两种模型随机各分成5组,每组10只。实验分3组,消结灵悬液剂量为3、6、9g/kg(60mg/ml,120mg/ml,180mg/ml),开始灌胃给药,每日1次,连续10日。对照1组灌胃等量生理盐水。对照2组灌胃给5-氟脲嘧啶(剂量为0.02g/kg)。停药24h,处死小鼠剥离摘出瘤体,称瘤体重量,统计抑制率。同时取材以备进行超微病理和免疫组化定位等研究。建立腹水型HAC和EAC模型,将瘤株(1×106)接种于小鼠腹腔,同样分组和灌胃给药,连续10日。停药后正常饲养观察动物生存天数,统计生命延长率。免疫组化染色选部分材料,用间接法,第一抗体为单克隆抗体Leu4,抗体为HRP-IgG,对T淋巴细胞做免疫组化定位研究。2结果2.1抗hac生命延长率消结灵对小鼠实验体型HepA抑制率为48%~70%;S180抑制率为36%~51%;抗HAC生命延长率为72.2%~75.9%;抗EAC生命延长率为73.7%~74.9%。2.2胞质形成动力学在电镜下观察对照组肝癌细胞的超微病理特征和实验组在消结灵作用下产生的超微病理改变。对照组超微病理特征:肝癌细胞核比正常肝细胞核明显增大且畸形,核膜多处深陷甚而呈花瓣状,核内常染色质丰富,异染色质多聚集在核膜内侧。胞质内细胞器较少,可见少量空泡变性的线粒体和较多的糖原颗粒。实验组超微病理改变:实验组肝癌细胞多呈破碎或凋亡状态,细胞膜与核膜多处缺损或断裂,膜周形成透明区。细胞器多呈变性状态,有少量含底物的高电子密度的次级溶酶体。癌细胞核大呈畸形,很多癌细胞的核仁解离与异染色质融合形成不规则的致密颗粒。胞质内有肿胀呈空泡变性的线粒体。很多癌细胞内形成大量类球形高电子密度的初级溶酶体和含底物的次级溶酶体。肝血窦内产生较多的枯否氏细胞,核呈梭形,常见1~2核仁,常染色较发达。胞质增生富含大量溶酶体和分泌泡,还有少量线粒体、糖原颗粒、粗面内质网和游离的多聚核糖体。其表面有较多的微突起。2.3t细胞基因突变采用间接法定位染色T淋巴细胞。一抗为单克隆性Leu4二抗HRP-IgG,显示T淋巴细胞的细胞膜与微突起及核膜呈细颗粒状锇黑为强阳性反应。3消结灵的作用机制纯中药片剂消结灵,具有扶正培本,清热解毒、理气化瘀、软坚散结之功效。通过应用消结灵治疗中晚期肝癌130例的疗效观察结果和建立4种抗癌动物模型统计其抑癌作用结果,又从分子水平观察超微病理改变和免疫组化定位,看到消结灵对癌瘤细胞具有直接或间接的杀伤破坏作用,抑制癌瘤细胞的分裂增殖,提高机体细胞免疫功能并通过免疫系统抑制和杀伤癌瘤细胞。现将消结灵抗癌瘤作用的途径和机理分析归纳如下。3.1胞失去支架屏障对细胞膜与核膜,它是由脂类、蛋白质和糖类构成的,一旦受到损伤不仅使癌细胞失去支架屏障而且破坏其物质运输、能量转换和信息传递等重要功能,最终致使癌细胞裂解凋亡。还与线粒体变性、糖原颗粒减少、核糖体溶解、常染色质消失、核仁颗粒化和DNA模板失活等而导致供能ATP与蛋白质合成障碍有密切关系。3.2核仁核仁细胞核具有储存遗传信息,控制细胞的代谢、分化和增殖等功能。癌瘤细胞不仅核大畸形,核质比例显著增高,而且核仁亦大数量常见2~4个,标明代谢增生活跃。核仁是核内重要结构,主要是合成核蛋白体核糖核酸(rRNA)并参与合成蛋白质。核仁解离呈颗粒化,染色质也融合于颗粒中,致使分裂增殖受阻。在电镜下大量观察实验组标本,尚未找到癌细胞有丝分裂象。3.3释放水解酶溶酶体在细胞内具有防御功能,正常细胞内含量较少。药效能诱导癌瘤细胞产生大量初级溶解酶体和含底物的次级溶酶体。并使初级溶酶体易释放出多种酸性水解酶,分解消化外来异物和癌细胞代谢毒素及变性细胞器,起到自杀性破坏癌细胞的作用。它释放出蛋白水解酶,能溶解肽链,破坏蛋白的合成,若释放出糖苷酶,能溶解糖链,同样破坏癌细胞。以上3项讨论表明,消结灵具有较强的细胞毒作用,实现软坚散结之功效。3.4t细胞作用检测很多文献报道,癌瘤患者细胞免疫功能低下,上海肿瘤医院于尔康等观察脾虚小鼠荷肝癌后T淋巴细胞功能下降。本实验组看到对照组与上述报道基本相同,但实组组看到消结灵能激活T淋巴细胞增生功能活跃。通过光镜观察E-玫瑰花形和淋巴转化实验看到其数量明显增加。电镜下观察在癌细胞之间有较多淋巴细胞浸润。用免疫组化间接法,对T淋巴细胞进行定位染色,看到其细胞膜与核膜呈细颗粒状锇黑为强阳性反应,结果证实,T淋巴细胞功能显著增强,提高了机体细胞免疫功能。电镜下还看到自然杀伤性淋巴细胞(又称癌导弹)数量也增加并直接攻击破坏癌细胞。3.5提高细胞免疫功能枯否氏细胞,即巨噬细胞存在于肝血窦内,正常状态下其数量不多。消结灵能促进其数增多,体积增大,细胞核常染色质丰富,细胞器发达富含大量溶酶体和分泌泡,表明其功能活跃。表面微突起较多,相当于伪足能游走移动,有的可穿透血窦内皮附着在癌细胞表面。它不仅有吞噬作用,还能分泌多种抑癌调节因子,抑制或杀伤癌细胞。它能分泌白细胞介素-1(IL-1),促进辅助性T细胞增殖分化;分泌δ-干扰素(δ-IFN),增强自然杀伤性淋巴细胞的攻击活性;分