复习基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序学习目标：1、简述基因工程原理及基本操作程序。2、记住目的基因导入受体细胞的方法。3、理解目的基因检测与鉴定的方法重点：基因工程基本操作程序的四个步骤，难点：1、从基因文库中获取目的基因。

2、利用PCR技术扩增目的基因。考点：基因工程原理及基本操作程序三、基因工程的基本操作程序1.目的基因的获取（1）目的基因：编码蛋白质的______。

基因1.目的基因的获取（1）从基因文库中获取目的基因：如从基因组文库或cDNA文库中获取。（2）利用PCR技术扩增目的基因：利用DNA复制的原理在体外特异性的复制某DNA片段以获得呈指数方式增加的目的基因。（3）人工合成法：通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。(3)PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等PCR技术DNA复制不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子2.基因表达载体的构建——基因工程的核心（1）由图可知载体的组成：_________、启动子、终止子、__________。目的基因标记基因①启动子、终止子:是基因转录的起点和终点，在转录过程中起调控作用。②标记基因:作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因。③目的基因：能控制特定性状的外源基因。（2）构建目的：①使________在_________中稳定存在，并且可以遗传给下一代；②使________能够表达和发挥作用。目的基因受体细胞目的基因(3)基因表达载体的构建步骤

导入的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。3．将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达将含有目的基因的表达载提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4.目的基因的检测与鉴定【点拨】启动子、终止子与起始密码子、终止密码子不同：启动子、终止子在DNA上,在遗传信息转录时起调控作用；而起始密码子、终止密码子在mRNA上,在翻译时起作用,决定翻译的开始和结束。【典例训练1】我国科学家成功克隆了控制水稻理想株型的关键多效基因IPA1。研究发现，基因IPA1发生突变后，会使水稻穗粒数和千粒重（以克表示的一千粒种子的重量）增加，同时茎秆变得粗壮，增加了抗倒伏能力。实验显示，将突变后的IPA1基因导入常规水稻品种，可以使其产量增加10％以上。下图表示该水稻新品种的简易培育流程，据图回答：（1）上图所示流程中步骤①是实验所用技术的核心步骤。此步骤使_________和_________构成_________

，常用的工具酶是________。突变的IPA1基因 Ti质粒重组DNA限制性核酸内切酶、DNA连接酶（2）若要在体外扩增IPA1基因可采用PCR技术。标准的PCR过程分为三个步骤，第一步是“变性”即解旋，这一步骤如果发生在细胞内，是在__________的作用下完成的。DNA解旋酶（3）从变异类型上分析，该水稻的新性状应该属于可遗传变异中的__________

。（4）④过程应用的主要生物技术是_______________。基因重组植物组织培养【互动探究】（1）图中将目的基因导入植物受体细胞常用的方法是什么？提示：农杆菌转化法。分析：将目的基因导入植物受体细胞常用农杆菌转化法。将目的基因导入动物受体细胞常用显微注射技术。（2）如何检测导入水稻新品种植株的目的基因是否表达？提示：进行抗原—抗体杂交法。分析：检测导入的目的基因是否表达常用抗原—抗体杂交法或进行个体水平的检测。【高考警示钟】

1.目的基因的插入位点不是随意的基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。2.基因工程操作过程中第三步没有碱基互补配对现象第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。【典例训练2】（2011·山东高考改编）人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。（1）图中的高血压相关基因作为________，质粒作为_______，二者需用___切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有__________有关。（2）重组DNA导入的受体细胞是大鼠的__________细胞，常用的方法是_________。在DNA重组过程中核心的操作是________。（3）子代大鼠如果__________和__________，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。（4）在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和________。目的基因 载体同一种限制性核酸内切酶受精卵限制性核酸内切酶的切割位点显微注射技术 基因表达载体的构建检测到相应蛋白质已患高血压胚胎移植【解题指南】1.考查实质本题主要考查基因工程的操作程序，涉及到胚胎工程技术。2.解题关键高血压相关基因与质粒形成重组DNA后导入到受精卵细胞中，是DNA重组技术。【解析】（1）根据题干中“利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠”推出，目的基因为与高血压相关的基因。为使目的基因与载体结合需用同一种限制性核酸内切酶切割。（2）重组DNA分子导入受体细胞中，植物细胞、动物细胞和微生物细胞导入目的基因的方式不同，动物细胞主要用显微注射技术将重组DNA分子导入细胞中。基因工程操作的第二步，即基因表达载体的构建是整个过程中的关键。（3）如果检测到相应蛋白质，即可在分子水平说明目的基因已经表达，如果检测子代大鼠已患高血压，即可在个体水平说明目的基因已经表达。

(4)在上述转基因大鼠的培育过程中，所用到的主要胚胎工程技术是体外受精、早期胚胎培养和胚胎移植。早期胚胎需要移植入体内，以提供一个稳定的环境和充足的营养供应。【互动探究】（1）如果把鼠换成植物，则导入受体细胞的常用方法改变吗？提示：变成农杆菌转化法。分析：植物细胞与动物细胞具有不同的特点，导入的方法是根据操作的需要进行的，如利用农杆菌易感染植物的特性。（2）分子水平检测除蛋白质检测外还有什么检测方法?提示：DNA分子杂交、核酸分子杂交。分析：利用DNA探针检测目的基因或相应的mRNA存在与否，说明目的基因是否存在或是否转录。1.（2012·福州模拟）浙江大学农学院喻景权教授的课题组最新研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。研究人员发现，用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450和GsT)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因的“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答：（1）获得油菜素内酯基因的方法有_____________（举二项即可）。第①步用PCR技术扩增基因时用到的耐高温的酶通常是指_____________。步骤②用到的酶有_____________。（2）图中导入重组质粒的方法是______________。在导入之前应用______________处理。（3）导入重组质粒以后，往往还需要进行检测和筛选，可用

______________制成探针，检测是否导入了重组基因；在培养基中加入______________可将含有目的基因的细胞筛选出来。（4）请你为该课题命名______________。（5）请你说说该研究发现的生态学意义：___________________________________。【解析】（1）油菜素内酯基因是目的基因，获得目的基因的方法有：从cDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用PCR技术扩增等。PCR技术中耐高温的酶是DNA聚合酶（Taq酶）。步骤②是对质粒进行剪切和拼接，要用到限制酶和DNA连接酶。（2）将重组质粒导入受体细菌中，采用Ca2+转化法，导入前应用CaCl2溶液处理，成为感受态细胞，增加受体细菌细胞壁的通透性。（3）对目的基因进行检测和筛选中应用红霉素抗性基因制成探针，检测是否导入重组基因；为筛选出含有目的基因的细胞可在培养基中加入红霉素。（4）课题命名可以是：探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解。（5）该项研

究的意义：加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康。答案：（1）从cDNA文库中获取、从基因文库中获取、人工合成目的基因或利用PCR技术扩增（任答两项即可）Taq酶限制酶和DNA连接酶（2）Ca2+转化法 氯化钙溶液（3）红霉素抗性基因 红霉素（4）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解（5）加速农药的分解，降低植物体内的农药含量，有利于环境保护和人体健康2.(2010·福建高考)红细胞生成素（EPO）是体内促进红细胞生成的一种糖蛋白，可用于治疗肾衰性贫血等疾病。由于天然EPO来源极为有限，目前临床使用的红细胞生成素主要来自于基因工程技术生产的重组人红细胞生成素（rhEPO），其简要生产流程如图。请回答：（1）图中①所指的是_______________技术。（2）图中②所指的物质是_______________，③所指的物质是

_______________。（3）培养重组CHO细胞时，为便于清除代谢产物，防止细胞产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换_____________。（4）检测rhEPO的体外活性需用抗rhEPO的单克隆抗体。分泌该单克隆抗体的____________细胞，可由rhEPO免疫过的小鼠B

淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成。【解析】本题主要以人红细胞生成素生产为材料来考查基因工程和细胞工程中动物细胞培养技术、制备单克隆抗体技术。获取目的基因的方法有四种（从基因文库中获取、用PCR扩增技术、用反转录法、用化学合成法），由图以核DNA为模板获得目的基因的方法可知①为PCR技术。进行反转录的模板是mRNA。由题意可知重组CHO细胞适用于生产重组人红细胞生成素(rhEPO），所以重组CHO细胞能够表达出重组人红细胞生成素(rhEPO）或者红细胞生成素。培养动物细胞是用液体培养基即培养液，细胞从培养液中吸收营养，并同时向培养液中排放代谢废物，当代谢废物积累时会危害细胞，因此要不断更新培养液。制备单克隆抗体是让B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞，然后由杂交瘤细胞来分泌抗体。答案：（1）PCR（2）mRNArhEPO

（3）培养液（4）杂交瘤3.(2011·海南高考)回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA

后，可能产生黏性末端，也可能产生________末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生________（相同、不同）黏性末端的限制酶。（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是____________。在用表达载体转化大肠杆菌时，常用____________处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为____________。为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成____________，常用抗原—抗体杂交技术。（3）如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的___________中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的____________上。【解析】（1）限制酶切割产生两种末端：黏性末端和平末端；若用DNA连接酶连接两个末端，两个末端必须是相同的。（2）基因工程检测的方法：检测目的基因是否导入，使用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录，使用分子杂交技术；检测是否形成蛋白质，使用抗原—抗体杂交技术。（3）基因工程的目的是获得稳定遗传的新品种，因此要把