电针频率对胃扩张疼痛大鼠拟痛行为学评分和下丘脑内疼痛信息物质p物质和-内啡肽表达的影响

电针频率对胃扩张疼痛大鼠拟痛行为学评分和下丘脑内疼痛信息物质p物质和-内啡肽表达的影响

内脏疼痛是由许多原因引起的内部内脏器官疼痛，与身体疼痛显著不同。这是临床上的一个普遍问题。目前,治疗内脏痛的方法虽然很多,然而疗效往往不能令人满意。大量临床观察证实,针灸疗法对内脏痛具有很好的缓解作用,但人们对其内在作用机制的了解仍相当有限。实验研究认为,针灸可通过抑制内脏痛信息传导,改变内脏痛活性物质的含量,从而治疗内脏痛。本实验建立了胃扩张疼痛模型,研究不同电针频率刺激对胃扩张疼痛大鼠的拟痛行为学评分、下丘脑内的疼痛信息物质P物质(SP)、β-内啡肽(β-EP)的影响,并分析这种变化与电针频率之间的关系,进而阐明针刺防治胃扩张疼痛可能的物质基础,探讨不同电针频率的效应差异,为临床治疗内脏痛提供相关的实验依据。1材料和方法1.1动物dSpragueDawley(SD)雄性大鼠,体重250～300g,清洁级,由湖南中医药大学实验动物中心提供,安静、室温20℃饲养。1.2仪器、试剂和仪器SABC免疫组化试剂盒、兔抗-SP试剂、兔抗β-EP试剂、DAB显色素(武汉博士德);SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(华佗牌,上海医用仪器厂),Shandon325型石蜡切片机(英国Shandon公司),MoticB5显微摄像系统(麦克奥迪),S.A.67120Millippore超纯水系统(法国),玉兔牌XJ11D型水银血压计(上海医疗设备厂),免疫组化专用磨砂玻片(北京鼎国)。1.3手术方法及频率50只大鼠随机分为5组,空白组、假手术组、模型组、低频电针组和高频电针组,每组10只。各组常规饲养,条件相同。除空白组外均按要求进行手术植入气囊造模;术后第3天模型组、低频和高频电针组进行胃扩张疼痛刺激,同期所有组进行拟痛行为学评分;第4天低、高频电针组开始进行不同频率电针处理,每日1次,共7d,其它组与电针组同期捆绑;第11日模型组、低频和高频电针组再次进行胃扩张疼痛刺激,同时各组再次进行拟痛行为学评分,评分后立即对所有大鼠麻醉、灌注取材,测定下丘脑各项指标。1.4大鼠胃压胃压参照Rouzade和Traub报道的方法,具体步骤如下:术前禁食12h,自由饮水;大鼠称重,10%乌拉坦(1ml/100g)腹腔麻醉,打开腹腔,游离胃大弯,在距贲门2cm处沿胃大弯剪开胃壁约1cm,放入气囊,再次确定气囊完好后固定气囊,荷包缝合胃壁,气囊所连接的导管经皮下隧道固定于大鼠颈部;术后当天禁食,次日按常规喂养3d,仍不能自由活动、不进食饮水者予以剔除;对模型组和电针组进行胃扩张疼痛刺激,给予40mmHg(1mmHg=0.133kPa)压力的时相性胃扩张(充气5min,间歇10min,交替进行,15min为1轮,共3轮),使大鼠产生胃扩张疼痛。1.5小鼠异形电针治疗根据新世纪全国高等中医药院校规划教材《实验针灸学》中大鼠针灸穴位定位方法及拟人比照法定取双侧“足三里”,在膝关节后外侧,腓骨小头下约5mm处。在腓骨间隙中皮下有腓神经及胫前动脉、胫前静脉分布。直刺约7mm,于针柄处接SDZ-Ⅱ型电针治疗仪。输出电压2～4V,输出电流1～3mA,强度以大鼠下肢轻颤为度。极性固定,负极接穴位,正极接鼠尾(无关电极),刺激时间30min。低频电针组为连续波,2Hz,脉冲宽度0.5ms;高频电针组为连续波,100Hz,脉冲宽度0.5ms。其电针仪输出频率均经SR8A型双踪示波器检测。1.6测试指标1.6.1行为指标及权重各组分别于植入气囊3、11d采用单盲法进行拟痛行为学评分。将大鼠放在自制鼠笼内,模型组、低频和高频电针组行胃扩张疼痛刺激3次,观察其拟痛行为学表现,每间隔10min观察行为学5min。评分标准参照Al-Chaer等的直肠腹壁撤回反射评分和预实验结果制定,对出现的行为依据其程度的不同分为0～3分4个等级。舔足频率:无:0分,1～2次/min:1分,3～5次/min:2分,5次以上/min:3分;抬颈频率:无:0分,1～2次/min:1分,3～5次/min:2分,5次以上/min:3分;弓背:无:0分,轻度:1分,中度:2分,重度:3分。各行为根据与胃扩张疼痛的相关性大小赋以不同的权重,总权重定为10,舔足频率W1=2,抬颈频率W2=3,弓背W3=5,最后计算综合评分。单个行为的评分为每轮扩张后评分的均值,综合评分=舔足评分XW1+抬颈评分XW2+弓背评分XW3。1.6.2电泳组化abc法各组均按随机表法随机取5只,腹腔注射10%乌拉坦(1ml/100g)麻醉,经左心室灌流固定,取下丘脑部石蜡包埋,石蜡块间断连续切片(厚度4μm)。免疫组化ABC法标记下丘脑SP阳性细胞和β-EP阳性细胞,摄片。用PBS代替一抗作阴性对照。P物质阳性细胞判定标准为细胞质或细胞核中出现棕黄色细颗粒,β-EP阳性细胞判定标准为细胞核中出现棕黄色颗粒。采用MIAS医学图像分析系统(北京航空航天大学),光镜下10X40倍,每张切片随机分析3个视野,计算每只大鼠下丘脑内的SP、β-EP免疫反应阳性细胞数(个/单位面积),取平均值。1.7组内和组间比较所有数据输入SPSS15.0统计软件进行处理,以均数±标准差(x±s)进行统计描述。各组数据进行正态性检验,符合正态分布者,组内自身前后比较采用配对t检验,不符合则采用配对计量资料比较的符号秩合检验;组间比较,符合正态分布者,采用单因素方差分析,方差齐者用LSD和SNK法,方差不齐者用Tamhane’s2T或Dunnett’sT3法;不符合正态分布,采用多个独立样本比较的秩和检验。2结果2.1电针前后疗效比较图1显示:①电针前后,与空白组相比,假手术组拟痛行为学评分无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,模型组、电针组拟痛行为学评分明显增高(P<0.01)。②电针后,低、高频电针组拟痛行为学评分明显降低,与电针前比较差异有统计学意义(P<0.01);其前后差值与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);且高频电针组拟痛行为学评分较低频电针组下降更明显(P<0.01)。2.2sp、-ep阳性细胞数检测,充分发挥了临床组金属酶的表达图2-4显示:①电针前后,与空白组相比,假手术组SP、β-EP阳性细胞数稍低,差异均无统计学意义(P>0.05);与假手术组比较,模型组、电针组的SP、β-EP阳性细胞数均明显增加(P<0.01)。②与模型组相比,低频电针组、高频电针组的SP、β-EP阳性细胞数亦明显增加(P<0.01)。③与低频电针组比较,高频电针组的SP、β-EP阳性细胞数增加幅度偏小(P<0.01)。3电针刺激对内脏痛模型的影响内脏痛作为应激刺激将引起机体行为学的改变。大鼠经过胃扩张疼痛刺激后,一般出现躁动不安、呼吸加深加快、心率加快、舔足、抬颈、上肢前撑、弓背等表现,可较客观地反映出了内脏痛的基本特征。本研究结果表明,不同电针频率刺激“足三里”能减轻大鼠对胃扩张疼痛的应激反应,使其拟痛行为学评分均有不同程度的降低,但未能恢复到正常水平。SP是一种多肽类物质,广泛分布于中枢神经系统中。目前认为SP在伤害性刺激和疼痛调制中具有重要作用。β-EP是内源性阿片肽家族的重要成员之一,主要作用就是参与痛信息的调控,即抑制痛信息的传递,发挥镇痛效应,其β-EP能神经元胞体主要分布在下丘脑和延髓等部位[-13]。Bao等研究认为,下丘脑部位SP、β-EP的含量增加与镇痛效应的产生密切相关。相关研究报道,电针刺激机体局部可引起中枢神经肽的合成与释放,从而发挥镇痛作用。梁繁荣等研究认为,电针可提高下丘脑β-EP的含量,这是发挥电针镇痛作用的中枢机制之一。陈瑾等的研究也支持这一观点。本实验观察到:造成胃扩张疼痛大鼠模型后,下丘脑内神经元SP、β-EP阳性细胞数有少量增加,提示疼痛应激引起了下丘脑内神经元SP、β-EP的合成少量增加,并释放参与疼痛调制;而经过不同电针频率刺激后,SP、β-EP继续明显增加,提示不同频率电针均促进了下丘脑内神经元SP、β-EP的大量合成,释放后显著加强了镇痛的作用,这与文献报道的结果基本一致。在电针参数对镇痛效应影响的临床和实验研究方面,一些研究者已经做了大量的工作,不同的电针刺激参数(主要是频率)均可以产生镇痛效应,但疗效优劣莫衷一是。如陈海林采用不同频率的穴位电刺激的方法对治疗252例急性软组织损伤疼痛的疗效做了观察,结果认为高频(100Hz)电针治疗急性疼痛短期治愈效果、整体疗效优于低频(2Hz)穴位电刺激。而李守栋运用不同频率电针在治疗腰椎间盘突出症的疼痛中则认为,10Hz低频电针组疼痛程度改善优于100Hz高频电针组。孙瑞卿等给予神经源性疼痛大鼠2Hz和100Hz电刺激,发现2Hz和100Hz电针均能减轻痛觉超敏,并且低频电针的镇痛效果优于高频电针。王洪蓓等[]研究发现,5Hz和100Hz两种频率电针对急性实验性关节炎大鼠均有明显的镇痛作用,而且可以显著升高下丘脑β-内啡肽的含量,但这两种频率电针的镇痛作用和升高下丘脑β-内啡肽含量并没有明显差异。本实验观察到:在拟痛行为学评分的改善方面,高频电针组的拟痛行为学评分在电针后明显低于低频电针组,说明高频电针的作用更强;在促进高位中枢内SP、β-EP的合成与释放方面,与低频电针组比较,在下丘脑部位高频电