卵母细胞浆内单精子注射卵母细胞的卵母细胞及卵裂胚胎发育质量分析

卵母细胞浆内单精子注射卵母细胞的卵母细胞及卵裂胚胎发育质量分析

自1992年以来，palm通过在全世界首次报告了卵母细胞内单次精神试验（icsi）技术获得正常收养以来，icsi作为治疗男性不育因素的有效措施，已成为世界上广泛开发的一项重要的辅助生殖技术。显微注射受精是ICSI技术中最关键的一个环节,与手术的结果有着密切的关系,国内目前对此研究很少,我们对显微注射受精过程中最主要的两个因素第一极体的位置和卵母细胞膜穿破类型对受精和胚胎发育的影响进行了研究。1数据和方法1.1男、女平均年龄和平均定位时间比较2001年8月至2002年1月在本中心接受ICSI治疗的患者86例,共91个周期,女方平均年龄为(32.0±4.8)岁(21~46岁),男方平均年龄为(33.9±4.9)岁(29~48岁),平均不育时间为(6.4±3.5)年(2~15年)。适应证为严重少、弱、畸精症、阻塞性无精症或尽管精液分析正常,但曾行常规IVF受精失败的患者。1.2方法1.2.1加用重组促卵激素与人绝经期促性腺激素联合促进泡菜发育所有患者均应用长方案诱导控制性超排卵,在手术周期前一个月的黄体高峰期应用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)降调节,本周期月经来潮第3d加用重组促卵泡成熟激素(Gonal-F)和人绝经期促性腺激素(Pergonal)联合促进卵泡发育。当2~3个优势卵泡直径大于18mm时,注射人绒毛膜促性腺激素(profasi),35h后B超引导下经阴道采卵。采卵后3~4h,将卵冠丘复合物(OCC)置于透明质酸酶中脱颗粒,只有成熟的MⅡ期卵母细胞用于ICSI。精液应用上游法处理。1.2.2显微注射方式使用Zeiss公司的倒置显微镜和显微注射仪,IVM公司的显微操作针进行显微注射受精。随机固定卵母细胞使第一极体于6点或12点的位置,进行显微注射。根据显微注射过程中卵母细胞胞膜穿破方式的不同,将其分为两种,A:显微注射针直接进入胞浆内,卵膜穿破,不形成凹痕,如果显微注射针轻易穿破卵膜形成轻微凹痕者也归于本组;B:显微注射针进入卵母细胞内,回吸少量胞浆,卵膜在细胞中部穿破,形成轻微的凹痕。对于A、B两组卵母细胞,显微注射针进针后均回吸少量胞浆,再将精子注入,对极体位置和卵膜穿破方式分别进行记录。显微注射受精均由同一操作者完成。1.2.3卵裂球数目和碎片数量显微注射受精后15~17h检查原核,有两个原核和两个极体存在者认为是正常受精。将受精后第3d的胚胎根据卵裂球数目和碎片数量分为三级:Ⅰ级胚胎为卵裂球数目≥6个,大小基本一致,碎片≤10%;Ⅱ级为卵裂球数目≥4个,大小均匀或轻度不均匀,碎片≤50%;Ⅲ级为卵裂球数目<4个,大小均匀或差别较大,碎片>50%。1.2.4胎室患者hc、-hcg融合受精后第3d,选择质量较好的3~4个胚胎移植并给予黄体酮肌注进行黄体支持,移植后14d检测尿、血HCG、β-HCG诊断妊娠,5周后B超检查孕囊、胚芽和胎心搏动。1.3统计处理数据行χ2检验。2m期卵母细胞获卵数及生物量本研究中86例患者91个采卵周期共获卵947个,每周期平均获卵数为10.4个,MⅡ期卵母细胞共782个(82.6%),生化妊娠35例,临床妊娠34例。因为收集病例数目有限,故未将妊娠率纳入本研究中进行评价。2.1卵母细胞存活率、受精率、卵裂胚胎发育情况显微注射受精过程中,第一极体位于6点时的卵母细胞存活率、卵母细胞受精率、卵裂胚胎发育质量均略高于12点位置,但差异均无显著性(P>0.05),见表1。2.2引物多态性与卵母细胞特征经显微注射受精的A、B组卵母细胞分别为172个和610个,A组的卵母细胞存活率为83.7%,B组为96.7%,A组明显低于B组,差异具有极显著的统计学意义(P<0.01),见表2。正常受精的A、B组卵母细胞分别为121个和507个,A组受精率为70.3%,B组为84.2%,差异具有显著性(P<0.05)。受精后第3d卵裂胚胎中,A组的Ⅰ级胚胎占25.8%,B组的Ⅰ级胚胎占37.7%,A组高质量胚胎明显少于B组,差异具有显著性(P<0.05)。3讨论3.1极体部位的影响多项研究表明90%左右的卵母细胞的纺锤体位于第一极体附近的位置,故显微注射受精时多用第一极体作为卵母细胞纺锤体位置的定位参照。对于第一极体位置与卵母细胞受精和卵裂的关系,许多学者的结论并不完全一致。Asch等认为进行显微操作时,注射针从3点的位置穿破卵母细胞膜,针尖开口向下,则注射针下方的胞浆及其显微结构更有可能因回吸引起丢失和破坏,既使得卵母细胞易于退化,也进而影响受精和胚胎发育。精子在卵母细胞内沉积的位置及其与纺锤体的距离也非常重要,当精子注入卵母细胞内之后,距离纺锤体越近,就有可能更好更早地激活卵母细胞,使之受精;距离越远,则受精延迟,胚胎的发育也相对缓慢,因此极体位于6点时有较高的受精率,也利于胚胎的早期发育。本研究结果显示极体位于6点时的卵母细胞存活率、卵母细胞受精率均略高于12点位置,但差异不显著,与Nagy等的结论一致,而在Nagy的研究中,极体位于6点时发育成的胚胎质量优于12点的位置,Blake等对不同极体位置的研究显示极体位于7点或11点时高质量胚胎的比例和胚胎的种植率最高,本研究极体在6点位置时卵母细胞的受精和胚胎发育的质量略优于12点位置,但差别不显著,关键是显微注射受精时精子沉积的位置既要靠近纺锤体利于受精,又要避免对纺锤体周围的胞浆影响过大,这是促进受精和胚胎发育的关键。最近PolScope和SpindleView影像系统的出现使操作者在显微操作过程中可以直接看到纺锤体,从而方便了显微注射点和精子沉积位置的选择,将有助于提高受精率和胚胎的发育。3.2膜穿破方式a组的优点本研究显示A组卵母细胞的存活率、卵母细胞受精率、卵裂胚胎发育质量均低于B组,差异具有显著性,与以往文献报道一致。卵母细胞膜穿破的方式与许多主、客观因素有关,如操作者的操作技巧、熟练程度,显微注射针的质量,显微操作系统的机械问题等都会影响ICSI的效果。在众多的因素中,卵母细胞膜的弹性是最为重要的。对鼠卵母细胞显微注射受精的研究提示B组卵母细胞膜穿破方式中形成的凹痕可防止卵母细胞退化,因为弹性凹痕的形成缓冲了胞浆回吸造成的压力,有助于胞膜完整性的恢复,减少了胞浆和部分细胞器的破坏和丢失,A组膜穿破方式提示卵母细胞膜弹性不足,脆性偏高,使得注射针的冲击力对卵母细胞显微结构的破坏性加强,故而A组细胞存活率低,易退化。另一方面,卵膜的穿破方式和卵母细胞本身的质量有密切的关系,有研究指出卵母细胞膜穿破方式的差异可能是由膜本身脂蛋白结构上的糖基支链等的不同所决定的。Palermo等还认为A组卵膜穿破方式和病人促排卵时间短