变异链球菌对牙面的黏附

变异链球菌对牙面的黏附

变异病原体是口腔中的一种重要引起的疾病。致虫性昆虫的主要活性因素是牙齿表面的粘附，糖含量的利用，以及强烈的酸和耐酸性。变异链球菌对牙面的黏附是其定植、致龋的基础。变异链球菌与龋齿有着非常密切的联系,明确变异链球菌的黏附机制有助于找到高效、方便、快捷且不良反应小的有效药物,以便龋病的预防和治疗。1黏附反应阶段黏附是微生物在特定的组织表面定植的首要条件,是微生物与宿主发生关系和致病的基础。其机制至今尚不完全清楚。主要的学说包括非特异性静电学说(钙桥作用)、氢键结合、疏水作用和特异性黏结素-受体学说。目前,备受关注的是黏结素-受体学说,即细菌表面的蛋白样成分或附属结构作为黏结素与组织表面特异性受体结合完成黏附作用。非特异性黏附,即非蔗糖依赖性黏附,是细菌黏附的第1步。当菌体与递质表面接触且间距为10~20nm时,两者间会产生排斥力,菌体可利用静电、氢键和疏水作用等物理化学力来克服这种排斥力;当间距小于10nm时,菌体与递质表面产生较强的引力,从而使菌体有机会进行特异性黏附。第2阶段是变异链球菌的葡糖基转移酶(glucosyltransferase,GTF)利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖来介导该菌的蔗糖依赖性黏附和集聚。GTF和葡聚糖可能通过提供葡聚糖结合蛋白(glucanbindingprotein,GBP)的结合位点直接影响变异链球菌初始黏附,因此,GTF催化产生的葡聚糖对初始黏附也有一定的意义。2特异性黏附的调节作用口腔细菌在牙面的选择性定居,主要是其表面黏结素与牙面受体分子以立体化学方式特异性结合的结果。黏结素通常是指细菌表面某种特定的蛋白质结构或糖脂成分,可存在于细菌细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、菌毛和微毛等结构中,在黏附中充当配体角色。受体则是存在于唾液中的一种能够识别和选择性结合特定配体的大分子物质,多为糖蛋白,一般包括与配体结合的区域和产生效应的区域。黏结素-受体介导的特异性黏附在细菌生物膜形成中起着决定性的作用。当受体与配体结合后,受体的构象改变并产生活性,启动一系列信号传导过程,最终表现为生物学效应。目前,与黏附有关的变异链球菌表面成分有细菌表面蛋白,如相对分子质量(Mr)为1.8×105的P1以及Mr为1.1×105、1.2×105、1.3×105的糖蛋白脂磷壁酸等。有报道称:GTF可作为变异链球菌的表面成分参与细菌对牙面的特异黏附。2.1菌表面蛋白初级结构的氨基酸序列及浓度变异链球菌的表面蛋白抗原P(surfaceproteinantigenP,SpaP)含有1500~1566个氨基酸残基,Mr为1.8~2.1×104。变异链球菌表面蛋白初级结构的氨基酸序列分为一个信号肽区(aa1~38),两个保守区[A区(aa186~464)和P区(aa840~963)],一个可变区[V区(aa679~823)],一个壁跨区(aa1486~1535)和一个跨膜区(aa1536~1556)。其中A区富含丙氨酸,含有82个氨基酸残基的重复序列,呈α-螺旋状,属于黏附功能区,与唾液糖蛋白具有高度的亲合力;P区富含脯氨酸,表现为高度疏水性,呈暴露状,形成伸展状态的β-片层结构,含有丰富的T、B淋巴细胞黏附表位,其近N端对人具有很好的免疫原性。2.1.1可溶性糖质糖化及其功能表面蛋白P1和P1样蛋白是变异链球菌主要黏结素之一,也是研究最多也是较肯定的黏结素。P1和P1样蛋白存在于细胞表面的绒毛层中,在血清型c变异链球菌中被称为P,其Mr为1.8×105,是主要的细胞表面抗原,含有两个主要的抗原决定簇,可通过蛋白溶解释放。P1和或P1样蛋白参与变异链球菌与牙面的非蔗糖依赖黏附,对变异链球菌在牙面的初始黏附起重要的作用。P1既能以共价结合方式存在于细胞壁,亦可脱离细胞壁成为游离态。P1一旦游离,则细菌的黏附能力下降。低pH值、细菌的高生长率、果糖替代葡萄糖作为糖源等均可使P1游离态增多,结合态减少,导致细菌在获得性膜上的黏附降低。P1还与变异链球菌的疏水性有关,即它可通过立体化学识别牙面受体和疏水反应而介导细菌黏附,表面疏水性越强的细菌黏附力越强。在人类的口腔中,疏水性菌株较亲水性菌株容易定居;因此,P1质量越高的变异链球菌,黏附性越强。Crowley等证实,缺乏表面蛋白抗原Ⅰ、Ⅱ的变异株,对无菌鼠模型的致龋性降低。周智等发现,随壳寡聚糖质量浓度的增高,变异链球菌的细胞表面疏水性明显下降,即壳寡聚糖可能对变异链球菌表面的疏水性分子表达有抑制作用,从而降低了细菌对牙面的黏附性。在就植物提取物对变异链球菌的疏水性和黏附作用的影响所进行的研究中,最低抑菌质量浓度(minimuminhibitoryconcentration,MIC)之下(7.81~31.25mg·L-1)的意大利永久花提取物降低了细胞表面的疏水性,对变异链球菌黏附到玻璃表面的抑制率接近90%。1g·L-1的可可块提取物对变异链球菌的疏水性有明显的抑制作用,对变异链球菌MT8148R的疏水抑制率达48%。程睿波等发现,随着白屈菜红碱溶液质量浓度的升高,变异链球菌的表面疏水性逐渐减弱,黏附率也随之降低。这表明白屈菜红碱可抑制变异链球菌细胞表面的疏水性和黏附作用,其机制可能是白屈菜红碱与表面蛋白间的化学反应引起表面蛋白化学结构的变化和数量的减少,从而降低了变异链球菌细胞表面的疏水性,并导致黏附减少。2.1.2重复区的基因免疫A区多肽的主动免疫或被动免疫,都可以激发宿主针对变异链球菌的特异性细胞免疫和体液免疫应答。无论是针对完整的SpaP的特异性抗体,还是针对SpaP的唾液结合功能区的抗体,都能明显阻碍变异链球菌在唾液包裹的羟磷灰石上的附着。Katz等发现,SpaP抗体能使啮齿类动物、灵长类动物和人的龋齿发生率明显降低。Takahashi等在使用SpaP的A重复区合成肽免疫小鼠时发现,变异链球菌在牙面的附着明显受到抑制。Redman等发现,表兄链球菌SpaP/A的抗体能保护大鼠免遭表兄链球菌所致的龋侵害。上述研究表明,表面蛋白抗体能有效阻断细菌最初在牙面的黏附、聚集和定植。刘天佳等以变异链球菌SpaP中的T、B细胞表位和黏附功能区相关肽段的编码基因为外源基因构建基因防龋疫苗,免疫动物检测到特异性表面蛋白抗原C(proteinantigenC,PAc)抗体,结果所构建的基因疫苗具有明显的防龋作用。贾荣等将SpaP/A区和P区同时克隆到载体质粒中构建防龋基因疫苗,免疫动物后可检测到特异性抗体。这些研究证实,根据PAc分子结构构建的多种基因工程防龋疫苗,都可激发宿主产生特异性细胞免疫和体液免疫应答,有效抑制变异链球菌在口腔中的定居与繁殖,降低龋齿的发生率。鉴于A区的分子结构及其重要的生物学功能,曲云鹏等将SpaP的A区编码基因克隆到可用于人体免疫的真核表达质粒pVAX1中,经转染真核细胞COS-7证实,该重组质粒能正确表达目的蛋白。以该重组质粒免疫动物能诱导机体产生针对SpaP/A区的特异性抗体,阻断变异链球菌对牙面的蔗糖依赖和非依赖黏附,起到防龋的作用。2.2变异链球菌发生蔗糖依赖在变异链球菌众多的表面抗原中,GTF无疑是最重要的。GTF能使蔗糖转化为水溶性葡聚糖(watersolubleglucan,WSG)和非水溶性葡聚糖(waterinsolubleglucan,WIG)。WSG又称右旋糖酐,通过α-1,6糖苷键连接葡糖基形成葡聚糖结构,主要作为细胞外能源储库及底物,诱导底物依赖性GTF合成水溶性和非水溶性葡聚糖;WIG又称变聚糖,通过α-1,3糖苷键将葡糖基彼此连接成葡聚糖。WIG具有黏性,在细菌黏附、菌斑形成中起着重要的作用,是变异链球菌致龋的主要毒力因子之一。变异链球菌在代谢过程中可以产生细胞外GTF,而GTF在变异链球菌的定植中起着关键性作用。大多数变异链球菌至少含有gtfB、gtfC、gtfD基因,少数还有gtfA基因。gtfB基因编码的GTF-Ⅰ合成WIG,gtfC基因编码的GTF-SI合成WIG和WSG的混合物,gtfD基因编码的GTF-S合成WSG。gtfD并非变异链球菌蔗糖依赖性定植所必需,而gtfB和gtfC则与变异链球菌蔗糖依赖性黏附密切相关。gtfB和gtfC失活可使变异链球菌丧失在牙光滑面上实施蔗糖依赖性定植的能力。根据gtfB的核苷酸序列推测,GTF-Ⅰ氨基酸序列中不含半胱氨酸,其5’端存在多个细胞外信号肽序列,3’端有3.5个正向重复序列单位。Chia等证实:gtfC紧靠gtfB下游,与gtfB有高度的同源性,DNA印迹分析得出多数同源基因含7.3kb的PstⅠ片段,有3个开放阅读框架;GTF-SI蛋白质整体呈亲水性,由1375个氨基酸残基组成,序列中几乎不含半胱氨酸。Ooshima等发现,只含一个编码WIG的gtf拷贝的变异链球菌合成WIG的能力差,不能实现在牙齿光滑面的定植,但插入gtfC后可增强其合成WIG的能力,从而使其能在牙齿光滑面定植。变异链球菌的许多菌株均可与葡聚糖反应并发生凝集,其分泌的GTF-S与葡聚糖有高度的亲和力,变异链球菌表面还有非酶性GBP。GTF还存在于人的唾液中,可进入早期获得性膜并合成葡聚糖,为GBP提供受体,从而直接参与牙面的初始定植。3影响粘土环境因素的环境因素3.1变异链球菌组织主要功能成分唾液对变异链球菌在牙面的定植起重要的调节作用。唾液中存在的可与变异链球菌反应、诱导其凝集的唾液凝集素(salivaryagglutinin,SAG),主要通过识别细菌表面蛋白来介导细菌的凝集或黏附。存在于液相中的SAG主要介导细菌凝集,吸附于固相上的SAG则介导细菌的黏附。变异链球菌与唾液的作用有如下几点。其一,不同的变异链球菌株,其表面的黏结素不同,不同的唾液组分促进了不同菌株的黏附。变异链球菌的黏附主要为黏蛋白和淀粉酶所促进,仓鼠链球菌(a)主要由富脯蛋白和淀粉酶促进,大鼠链球菌(b)由富脯蛋白和IgA促进,表兄链球菌则不受唾液成分的影响。其二,不同状态的SAG对变异链球菌的黏附作用不同。溶液中的SAG可诱导细菌凝集或通过封闭细菌表面唾液结合点,有利于消除细菌;SAG吸附于牙面后构型可发生改变,暴露出变异链球菌黏结素的结合位点,促进黏附。其三,唾液成分空间构象和分子结构对变异链球菌黏附有影响。一些SAG经理化处理降解变性后,分子结构和空间构象发生改变,失去了与变异链球菌结合的能力。其四,不同个体的唾液对变异链球菌黏附定植的影响和凝集变异链球菌的能力不同,且唾液的凝集力同变异链球菌感染水平呈负相关。牛奶中的乳铁蛋白(lactoferritin,LF)对SAG与细菌的结合具有抑制作用,且呈剂量依赖性。其中,主要的功能成分是LF411(473538位氨基酸残基)片段。尽管LF是一种离子结合型蛋白,其离子结合能力会影响其生物学功能,但是在LF411片段上并没有离子结合位点,且LF411与半胱氨酸清道夫受体家族P-2片段的结合也不需要离子的存在。目前,尚不太清楚LF对变异链球菌黏附的具体机制,需进一步深入研究。Oli等发现,当变异链球菌编码PAc的基因被取代后,其与GP-340的凝集和黏附活性受到不同程度的抑制。针对PAc不同位点的单克隆抗体可阻断变异链球菌与SAG的黏附,而多克隆抗体的阻断作用则更强。3.2基于葡萄糖的初始黏附素姜颖等发现,质量分数5.0%的葡萄糖组黏附力最强,0.2%的葡萄糖组黏附力最低,1.0%的葡萄糖组黏附力界于两者之间,即一定范围内高质量分数的葡萄糖可促进变异链球菌的初始黏附。这既可能缘于充裕的葡萄糖为变异链球菌合成蛋白质提供了更多的前体和能源,有利于变异链球菌表面黏附素的表达,促进变异链球菌spaP基因的表达;也可能缘于充裕的葡萄糖影响转肽酶SrtA和内源性表面蛋白释放酶的活性,但其确切的分子机制是今后的研究方向。3.3ph对变异链球菌的影响在pH5.5的酸性环境中,初始黏附能力较强和较弱变异链球菌菌株的spaP表达均明显下降;不过在pH为酸性或中性的环境中,初始黏附力强的变异链球菌的spaP表达均明显高于初始黏附力弱的变异链球菌。pH对变异链球菌某些基因的表达及其蛋白的质和量都有重要的影响。Browngardt等发现,糖类和pH对于变异链球菌的主要毒力因子ftf和gtf-BC的表达起重要的调控作用。变异链球菌能耐受恶劣环境主要得益于其能产生一些应激蛋白,这些蛋白通过折叠新合成的或者变性的蛋白质聚集、转运、降解细胞蛋白而在细胞的代谢中起重要的作用。酸性环境使变异链球菌的spaP表达下调,可能缘于在酸性环境中变异链球菌倾向于合成更多的应激蛋白以耐受环境的刺激,而其他非应激蛋白的合成受到了抑制。酸性环境抑制变异链球菌的spaP表达,可能是酸性环境中变异链球菌初始黏附下降的原因之一。在不同pH环境中,初始黏附力强的变异链球菌菌株的spaP表达总体上高于黏附力弱的菌株,即变异链球菌黏附力可能与其黏附毒力因子的基因表达有关。更好地阐释变异链球菌的黏附机制,有利于发现控制牙菌斑生物膜形成的有效措施,可更有针对性地预防龋病的发生。3.4蔗糖质量分数对变异链球菌黏附的影响壁相关蛋白(wall-associatedprotein,WAP)A又称抗原A、抗原Ⅲ,是一种Mr为2.9×104的表面蛋白,编码基因约长1359bp。在Qian等插入灭活变异链球菌的wapA后,其突变株的集聚能力和蔗糖依赖性黏附能力分别下降了52%和40%,证实WapA在变异链球菌蔗糖依赖性黏附中起着非常重要的作用。Zhu等也发现,wapA突变株形成的链明显变短,细菌间聚集明显减少,细胞表面超微结构改变,细胞表面黏性下降。随着环境的改变,生物膜中细菌的许多生物活性和功能发生相应的变化。蔗糖是人类食用较多的糖类之一,所合成的水不溶性细胞外多糖参与变异链球菌蔗糖依赖性黏附,蔗糖的供给情况是影响变异链球菌黏附的另一主要环境因素。为明确蔗糖促进变异链球菌黏附的内在机制,有研究检测在不同蔗糖质量分数环境中,参与变异链球菌蔗糖依赖性黏附wapA的表达情况。结果显示,随着蔗糖质量分数(0.5%、1%、5%)的增加,黏附性较强的变异链球菌菌株wapA表达上调,黏附性较弱的菌株wapA表达先上调而后下降,但其变化差异无统计学意义。即在一定质量分数范围内,蔗糖质量的增加对变异链球菌wapA表达的影响不大。在不同质量分数的蔗糖环境中,黏附性较强的变异链球菌