药物仪器分析技术第二章 紫外-可见吸收光谱法

紫外-可见吸收光谱法第二章

目录CONTENTS01基本知识02紫外-可见分光光度计03定性定量分析04实训三

吸收系数法测定维生素B1片的含量测定05实训四

双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁唑片的含量案例导入

血红蛋白减少见于临床上各种原因的贫血，通过血红蛋白的测定可诊断贫血，明确贫血程度。血红蛋白的测定多用氰化高铁血红蛋白测定法。其基本原理是：血液中除硫化血红蛋白外的各种血红蛋白均可被高铁氰化钾氧化为高铁血红蛋白，再和CN¯结合生成稳定的棕红色复合物-氰化高铁血红蛋白，其在540nm处有一吸收峰，用分光光度计测定该处的吸光度，经换算即可得到每升血液中的血红蛋白浓度，或通过制备的标准曲线查得血红蛋白浓度。基本知识第一节011.能说出光的吸收定律。2.能区别透光率和吸光度。3.能应用光的吸收定律进行计算。4.能说出不同的吸光系数的含义。5.能说出吸收光谱曲线中横坐标C、纵坐标A和λmax的含义。学习目标光是一种电磁波，具有波动性和粒子性，即光的波粒二象性。光的波动性常用波长或频率来描述；光的粒子性是把光作为具有一定能量的光子(或光量子)来描述。按波长顺序排列的电磁波称为电磁波谱。人眼能感觉到的光称为可见光，其波长在400〜760nm；人眼觉察不到的还有红外线、紫外线、X射线等。光的本质与物质的颜色011.光的本质单一波长的光称为单色光,由不同波长的光混合而成的光称为复合光。两种适当颜色的单色光按一定强度比例混合可成为白光，这两种单色光称为互补色光。光的本质与物质的颜色011.光的本质图2-1

光的互补色示意图溶液的颜色，是由于物质选择性地吸收了可见光中某一波长的光而产生的。当一束白光通过某溶液时，如果溶液对各波长的光完全吸收，则溶液显黑色；如果该溶液对各波长的光都不吸收，则溶液无色透明。如果溶液选择性地吸收了白光中的某一色光，则溶液呈现透过光的颜色，即溶液呈现的颜色是它所吸收光的互补色。光的本质与物质的颜色012.物质对光的选择性吸收光的吸收定律021.透光率与吸光度Io

图2-2

光照射溶液示意图

Ir当一束平行的单色光照射到均匀无散射的溶液时，若入射光强度为Io，吸收收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，如图2-2所示。

Io=Ia+It+Ir

光的吸收定律021.透光率与吸光度Io

图2-2光照射溶液示意图

Ir在分光光度法中，通常把待测溶液和参比溶液分别置于材质及厚度相同的吸收池中，所以两个吸收池的反射光强度基本相同且可以忽略不计，因此上式可简化为：

Io=Ia+It

光的吸收定律021.透光率与吸光度Io

图2-2光照射溶液示意图

Ir透光率（或透光度）：指透过光强度It与入射光强度Io之比，用符号T表示，即：光的吸收定律021.透光率与吸光度Io

图2-2光照射溶液示意图

Ir吸光度：透光率（T）的倒数反映了物质对光的吸收程度，透光率的负对数称为吸光度，用A表示，即：光的吸收定律02

当一束平行的单色光通过均匀、无散射的含有吸光性物质的溶液时，在入射光的波长、强度及溶液的温度等条件不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液的浓度c及液层厚度L的乘积成正比。这一结论称为光的吸收定律，也称为朗伯-比尔定律。其表达式如下：2.光的吸收定律（朗伯-比尔定律）光的吸收定律02光的吸收定律表明了物质对光的吸收程度与其浓度和液层厚度之间的数量关系，因而是分光光度法定量的基础；不仅适用有色溶液，也适用无色溶液及气体和固体的非散射均匀体系;不仅适用于可见光区的单色光，也适用于紫外光和红外光区的单色光。2.光的吸收定律（朗伯-比尔定律）摩尔吸光系数指波长一定时，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸光度，用ε表示，单位为L/（mol·cm）。即：指波长一定时，溶液浓度为lg/100ml,液层厚度为1cm时的吸光度,用表示，单位为100ml/（g·cm）。即：百分吸光系数光的吸收定律023.吸光系数摩尔吸光系数与摩尔吸光系数的关系光的吸收定律02吸光系数是物质的特性常数之一,是物质对一特定波长光的吸收能力的体现；吸光系数越大，表明吸光能力越强，灵敏度越高；不同物质对同一波长的光有不同的吸光系数，同一种物质对不同波长的光也有不同的吸光系数；吸光系数是分光光度法进行定量和定性分析的依据。3.吸光系数吸收光谱曲线03图2-3不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线

在溶液浓度和液层厚度一定的条件下,用不同波长的光，按波长顺序分别测定溶液的吸光度，以波长（λ）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，所描绘的曲线称为吸收光谱曲线，简称吸收曲线。吸收光谱曲线03图2-3不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线

从图2-3可见（1）不同浓度的KMnO4溶液的吸收曲线形状相似，对波长为525nm附近的绿色光吸收最强。吸收程度最大处的波长称为最大吸收波长，用λmax表示。KMnO4溶液的λmax=525nm。吸收光谱曲线03图2-3不同浓度的KMnO4溶液的吸收光谱曲线

从图2-3可见（2）对于不同物质，由于组成和结构不同,其吸收光谱的形状和λmax也不相同，这些特征可作为物质定性分析的依据。（3）对于同一种物质,在一定波长下的吸光度随溶液的浓度增加而增加，这一特性可作为物质定量分析的依据。在定量分析中，一般选择在最大吸收波长（λmax）处测定吸光度。紫外-可见分光光度计第一节021.能够说出光源、单色器、吸收池、检测器、信号处理及显示器五大主要部件。2.能够根据不同的光路图，区别不同类型的分光光度计。3.熟练完成分光光度计的使用及养护，并能够准确避免相关的注意事项。4.能够了解仪器使用过程中的指标信息及含义。学习目标在200～800nm波长范围内，能够任意选择不同波长的单色光用来测定溶液的吸光度（或透过率）的仪器，称为紫外-可见分光光度计。紫外-可见分光光度计的型号繁多，但其主要部件的结构和工作原理相似，主要由光源、单色器、吸收池、检测器及信号处理及显示器五部分组成。基

本

结

构01紫外-可见分光光度计

光源是提供一定强度、稳定且具有连续光谱的光，不同光源可以提供不同波长范围的光波。紫外-可见分光光度计中安装有两种光源氢灯（或氘灯）和钨灯（或卤钨灯）。紫外光区通常釆用氢灯或氘灯，适用波长范围是200～360nm；可见光区釆用钨灯或卤钨灯，适用波长范围是350～800nm。1.光源基

本

结

构01单色器作用是将来自光源的复合光色散成按一定波长顺序排列的连续光谱，从中分离出一定宽度的谱带。由狭缝、准直镜、色散原件（棱镜和光栅）、聚焦透镜组成，如图2-4所示。其中色散原件是关键部件，常用的色散原件有棱镜和光栅。2.单色器基

本

结

构01图2-4（a）光栅单色器（b）棱镜单色光器示意图

用来盛放溶液的容器称为吸收池，也叫比色皿或比色杯。按材质不同，分为玻璃吸收池和石英吸收池。在可见光区测定时，可用玻璃吸收池或石英吸收池;在紫外光区测定时，必须使用石英吸收池。吸收池上的指纹、油污或池壁上的污物都会汚响其透光性，因此使用前后必须彻底清洗。3.吸收池基

本

结

构01检测器是将通过吸收池的光信号转换为电信号的电子元件，常用的是光电管和光电倍增管。光电倍增管是目前应用最广泛的检测器，性能较好。4.检测器基

本

结

构01显示器的作用是把放大的讯号以适当的方式显示或记录下来。一般配有计算机，进行数据显示和处理,根据选择的模式可直接显示透光率（T）、吸光度（A）或浓度（c）等。5.信号处理及显示器基

本

结

构01单光束分光光度计以钨灯或氢灯为光源，从光源到检测器只有一束单色光。仪器结构比较简单，对光源发光强度要求较高。如国产722型（外形如图2-5所示）、751型、UV755B型（外形如图2-6所示）等。1.单光束分光光度计

类

型02图2-5722型可见分光光计外形图图2-6UV755B型紫外-可见分光光度计外形图双光束分光光度计的光路系统如图2-7所示。由于两光束同时分别通过参比液和试样液，自动消除光源变化所引起的误差。2.双光束分光光度计

类

型02

图2-7双光束分光光度计光路示意图

双波长双光束分光光度计的光路系统如图2-8所示。优点：

测定时不需要参比池，可以避免吸收池不匹配、参比溶液与试样溶液的折射率和散射作用不同而产生的误差，特别适于在有背景吸收干扰或者有共存组分吸收干扰的情况下，对某组分进行定量测定。3.双波长分光光度计

类

型02

图2-8双波长分光光度计光路示意图

打开电源开关，点击工作站图标，仪器开始初始化自检；仪器初始化时不能打开样品室的盖子。质量标准：自检通过，否则仪器无法工作。2.开机 1.开机前开机前确认紫外-可见分光光度计光路里无异物检查。质量标准：光路里应无异物；有异物取出异物。按仪器说明书预热。质量标准：预热后光源稳定。3.预热 操

作

规

程03将挡光板放入供试品的光路中(进口仪器不需校正)。 质量标准：消除仪器部分噪声带来的误差。根据实验目的选择光度测量模块、光谱扫描模块等不同模块。质量标准：核对供试品的最大吸收波长时选择光谱扫描；定量测定时选择光度测量。5.选择工作室模块4.溶液的配制按要求标准配制供试品溶液、对照品溶液。质量标准：严格按照标准配制供试品溶液、对照品溶液，以及相关试剂。6.暗电流校正 操

作

规

程03将装入空白溶液的2个吸收池，放入仪器中校零或校基线。质量标准：排除溶剂、容器的吸收，光的散射和界面反射等对测定结果的影响。8.校零或校基线7.参数设置根据标准设定波长、光度模式、光谱带宽、换灯波长；波长范围、扫描速度、扫描间隔等参数。质量标准：根据实验目的确定被测物的参数。倒出供试品光路中吸收池的空白溶液，用供试品溶液冲洗3次。装入4/5高度的供试品溶液，置供试品光路中。质量标准：扫描光谱图。9.扫描图谱 操

作

规

程03在光度模式下，测定吸光度值。 质量标准：测得供试品溶液及对照品溶液的吸光度值。11.测吸光度10.图谱处理选中图谱文件，点击工具栏上的峰值检出。 质量标准：核对供试品的最大波长是否在范围内，否则检查仪器及溶液是否有误。退出工作站，关闭仪器及电脑电源，取出吸收池。 质量标准：仪器及电脑全部关机。12.关机 操

作

规

程0313.原始记录及报告书 正确填写原始记录及报告书；数据处理正确。质量标准：原始记录要符合记录与数据管理的相关要求。12.关机 操

作

规

程031.开机后，应打开样品室的盖子，预热20分钟。2.确定波长位置，调整透光率为0%和100%位后，在测量过程中，不应再改变波长、0%和100%位。3.在测定过程中如果需要改变波长，应在改变波长后适当增加仪器的稳定时间,再重新调透光率为0%和100%位。4.避免在仪器上方倾倒试样溶液，以免试样溶液污染仪器表面，损坏仪器。5.吸收池应仔细清洗，保证其光洁度，避免摩擦吸收池透光面。若吸收池的透光玻璃面有残液，应用镜头纸吸干。6.准确记录吸光度值，注意有效数字位数。使

用

过

程

的

注

意

事

项041.测光方式2.测光准确度3.波长范围4.波长准确度5.波长重复性主

要

技

术

指

标0510.分辨率6.狭缝或光谱带宽7.杂散光8.吸光度范围9.吸光度重复性10.分辨率由于仪器不够精密,如读数盘标尺刻度不够准确、吸收池的厚度不完全相同及池壁厚薄不均匀等;光源不稳定、光电管灵敏性差、光电流测量不准等因素，都会引入误差。2.仪器和测量误差1.偏离朗伯-比尔定律引起的误差溶液中吸光物质不稳定； 单色光不纯。处理样品溶液和标准溶液时没有按完全相同的条件和步骤进行，如溶液的稀释、显色的用量、反应温度、放置时间等都可能引入误差。3.操作过程引入的误差 误

差

的

来

源06许多有色物质的颜色随溶液的酸度改变而改变,大多显色反应对溶液的酸度有一定的要求.2.溶液的酸度1.显色剂的用量为使显色反应尽量完全，一般加入过量的显色剂。常通过实验结果来确定显色剂的用量。大多显色反应在常温下进行，有些显色反应需要加热才能完成。升温可加快反应速度，但也可产生副反应，所以，应根据具体的反应选择适当的温度。3.显色温度 显

色

反

应07常通过控制显色反应的酸度，或加入掩蔽剂，或预先通过离子交换等方法来掩蔽或分离共存离子。5.共存离子的干扰及消除4.显色时间

4.显色时间有些显色反应需要经过一段时间后才能达到平衡，溶液对特定波长的光的吸收才能稳定。有些化合物放置一段时间后，因空气的氧化、光的照射、试剂的挥发或分解等,溶液的吸光性才能达到稳定。一般通过实验来确定所需的最佳时间。3.显色温度 显

色

反

应07读数范围应控制在吸光度为0.1～0.8、透光率为20%～80%时误差较小。可以通过控制试样的取样量来实现:对于组分含量高的试样，应减少取样量或稀释试液;对于组分含量低的试样，则可增加取样量或用富集方法提高被测组分的浓度。如果试液已经显色，则可通过改变吸收池厚度的方法来改变吸光度值。2.选择适当的吸光度读数范围1.波长的选择根据“吸收大、干扰小”的原则选择测量波长。空白溶液应当是与配制样品溶液条件相同而不含样品的溶液。样品溶液的浓度必须控制在标准曲线的线性范围内。3.选择合适的参比（空白）溶液 测

量

条

件

的

选

择08定性定量分析第一节031.能使用紫外-可见分光光度法进行定性分析样品。2.能对样品的吸收曲线进行分析，获得最大吸收波长(λmax)。3.能使用定量分析方法进行样品的测定，并处理实验数据。学习目标定性分析01在相同的量条件下，分别测定未知物与标准物对不同波长的吸光度，绘制吸收光谱曲线图，比较二者是否一致。将未知物的吸收光谱与标准吸收光谱直接比较如果两个吸收光谱的形状，包括吸收光谱上吸收峰的数目、最大吸收波长(λmax)、摩尔吸光系数（ε）等完全一致，则初步判断未知物与标准物可能是同一化合物。定量分析02对在紫外-可见光区有吸收的无机和有机化合物进行定量分析；使紫外-可见光区的非吸收物质与某些试剂发生“显色反应”生成有强烈吸收的产物,实现对“非吸收物质”的定量测定；定量分析的理论依据是光的吸收定律，即

。定量分析021.标准曲线法操作方法配制一系列浓度不同的标准溶液，以不含被测组分的空白溶液作为参比溶液,在相同条件下测定各标准溶液的吸光度，绘制A-c曲线图，称为标准曲线（或工作曲线），如图2-9所示。在相同条件下测出样品溶液的吸光度，在标准曲线上可查出其样品溶液相应的浓度。定量分析022.比较法（标准对照法）操作方法一在相同实验条件下,配制样品溶液和标准品溶液（样品溶液中被测组分与标准组分是同一物质），在选定最大波长处，分别测量其吸光度，根据朗伯-比尔定律，得：注意事项光的吸收定律只适用于稀溶液，所以在测定溶液的吸光度时需要将原样品溶液进行稀释，然后根据下式计算原样品液的浓度。

c原液=c样×稀释倍数定量分析022.比较法（标准对照法）操作方法二测定不纯试样中被测组分含量时，可配制相同浓度的试样溶液ρ样和标准品溶液ρ标，在最大吸收波长λmax处分别测定其吸光度A样和A标，设ρx为试样溶液中被测组分的浓度，则被测组分的质量分数为：

定量分析023.吸光系数法（绝对法）操作方法利用光的吸收定律表达式A=KcL进行计算的定量分析方法，在手册中査出待测物质在最大吸收波长λmax处的吸光系数ε或并在相同条件下测量样品溶液的吸光度A,然后计算其浓度。实训三

吸收系数法测定维生素B1片的含量第一节041.掌握片剂紫外-可见分光光度法的基本操作。2.掌握吸收系数法测定维生素B1含量的基本原理和计算。3.掌握片剂的取样方法。01实训目的１.器材紫外-可见分光光度仪。２.试药维生素B1片，其规格为每片含维生素B15mg和每片含维生素B110mg两种。3.试剂盐酸溶液（9→1000）。实训准备02

取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素B125mg），置100ml量瓶中，加盐酸溶液（9→1000）约70ml，振摇15分钟使维生素B1溶解，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，用干燥滤纸滤过，精密量取续滤液5mL，置另一100mL量瓶中，再加上述溶剂稀释至刻度，摇匀。照紫外-可见分光光度法，在246nm的波长处测定吸光度，按

的吸收系数（

）为421计算，即得。03实训内容与步骤1.方法

式中:A为吸光度；

为百分吸收系数；L为液层厚度，cm,如无特别注明，L=1cm；D为稀释倍数；03实训内容与步骤2.计算

V为供试品的溶解体积，mL；

取为供试品的取样量，g；

为平均片重,g；

为

隐含的单位。吸收系数法测定维生素B1片的含量数据记录与处理03实训内容与步骤3.结果与数据处理样品名称

规格

样品来源

检验员

样品批号

检验依据

所用仪器

所用试剂

20片质量/g

平均片重（m片）/g

供试品取样量（m样）/g

供试品的溶解体积（V）/mL

供试品溶液的稀释倍数（D）

供试品溶液吸光度（A）

平均值:本品含维生素B1占标示量的百分比/（%）

维生素B1片中含有辅料，测量前应进行过滤操作。本实验先定容，后过滤，过滤时，所用仪器均需干燥。弃去初滤液，精密量取续滤液进行分析，保证浓度一致，从而保证结果的准确。掌握片剂的取样方法，并正确计算取样量范围。03实训内容与步骤4.注意事项实训测评04序号考核内容考核标准配分得分1文明操作符合HSE规定5

2溶液配制正确配制盐酸溶液（9→1000）5

3仪器使用正确开机预热5

正确调节波长5正确使用比色皿104实验操作空白溶液校零10

待测溶液的润洗10

5实验结果精密度（相对极差）≤0.50％满分；每增加0.50%扣5分，扣完为止。25

含量符合中国药典规定得10分，不符合得0分。10

6数据记录及时记录数据（发现篡改数据本实训计0分）10

7结束工作完成整理和清洗工作5

合计100

1.简述片剂过滤的操作要点。2.如果维生素B1片的规格是10mg，试问取样量范围是多少。05实训思考实训四

双波长分光光度法测定复方磺胺甲噁唑片的含量第一节051.掌握双波长分光光度法的基本原理。2.掌握复方制剂不经分离直接测定各组分含量的方法。3.学会用单波长型分光光度仪进行双波长含量测定。01实训目的

选择两个波长λ1和λ2，待测物质在这两个波长处的吸光度之差ΔＡ（选λ1作参比波长、λ2作测定波长，可直接读出ΔＡ）与待测物质浓度成正比，而与干扰物浓度无关。02实验原理１.器材紫外-可见分光光度仪２.试药复方磺胺甲噁唑片，磺胺甲噁唑对照品，甲氧苄啶对照品3.试剂乙醇，0.4%氢氧化钠溶液，盐酸-氯化钾溶液实训准备03（1）供试品溶液制备:

取本品10片，研细，精密称取适量（约相当于磺胺甲噁唑50mg与甲氧苄啶10mg）,置100mL容量瓶中，加乙醇适量，振摇15min使磺胺甲噁唑与甲氧苄啶溶解，加乙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。04实训内容与步骤1.磺胺甲噁唑的测定（2）对照品溶液制备:精密称取在105℃干燥至恒重的磺胺甲噁唑对照品50mg与甲氧苄啶甲氧苄啶对照品10mg,分别置100mL容量瓶中，各加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品溶液（Ⅰ）与对照品溶液（Ⅱ）。04实训内容与步骤1.磺胺甲噁唑的测定（3）测定方法:

精密量取供试品溶液与对照品溶液（Ⅰ）（Ⅱ）各2mL,分别置100mL容量瓶中，各加0.4%氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，取对照品溶液（Ⅱ）的稀释液，以257nm为测定波长（λ2），在304nm波长附近（每次试测时间隔0.5nm）选择等吸收点波长为参比波长（λ1），要求

。再在λ2与λ1波长处分别测定供试品溶液的稀释液与对照品溶液（Ⅰ）的稀释液的吸光度，求出各自的吸光度差值（∆A）,计算，即得。04实训内容与步骤1.磺胺甲噁唑的测定

精密量取上述供试品溶液与对照品溶液（Ⅰ）（Ⅱ）各5mL,分别置100mL容量瓶中，各加盐酸-氯化钾溶液（取0.1mol/L盐酸溶液75mL与氯化钾6.9g,加水至1000mL,摇匀）稀释至刻度，摇匀，照分光光度法，取对照品溶液（Ⅰ）的稀释