猪线虫病的分离方法

猪线虫病的分离方法

收集昆虫尸体是所有寄生虫学和研究所需要的。近年来，国内外关于线虫成虫相关基因的研究报道较多，而对幼虫特异性基因的报道甚少，其主要原因之一是较难获得大量高纯度的幼虫。寻找分离幼虫的有效方法将为研究幼虫发育的特异基因、开展幼虫体外培养技术、进行RNA干扰等研究奠定良好的基础。本实验以猪蛔虫为模型，对不同发育期幼虫的分离制备方法进行了研究。1材料和方法1.1小鼠5人蛔虫：从深圳某屠宰场采集。实验动物：由广东省某种猪场提供20～25kg/只的小猪5只。漏斗：直径30cm的漏斗数个。纱布和分样筛：医用纱布，江苏常州红旗纱筛厂产300目、200目标准分样筛。玻璃珠：由北京鼎国生物技术发展中心提供。1.2实验方法1.2.1卵粒及感染情况调查从深圳某屠宰场采集新鲜猪蛔虫成虫后，用灭菌生理盐水清洗数次；区分雌雄后，立即解剖雌性成虫；收集子宫的后1/2段，用灭菌的PBS液在研钵内稍加研磨后，加PBS液及1.5%福尔马林液各清洗、离心2次，弃上清，将沉淀放入培养皿中培养。培养方法：在培养皿上先铺上一层约0.5cm厚的棉花，在棉花上铺一层滤纸；将沉淀均匀铺在滤纸上，并在上面滴数滴1.5%福尔马林液，以保持底部棉花的湿润并起到抗菌作用。盖上皿盖，28～30℃温箱培养30d左右。培养期间，定期添加1.5%福尔马林液。每隔一周取样镜检观察虫卵的发育情况。约28d后，虫卵已基本发育成感染期蛔虫卵。收集这些感染性虫卵，于4℃保存备用。1.2.2离心柱的制备取部分感染性虫卵，用40目铜筛过滤，收集滤液于50ml离心管中，加7.5%次氯酸钠，37℃过夜后，用灭菌的0.9%生理盐水离心数次，充分洗去次氯酸钠，最后将沉淀用1.5ml离心管分装，加数粒玻璃珠，并加生理盐水至刚好淹没玻璃珠，在振荡器上振荡5min至卵壳破裂，幼虫孵出。用200目分样筛过滤去除玻璃珠，收集滤液，并按彭国华等报道的方法进行改良后分离滤液中的幼虫和破裂卵壳。即用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法离心滤液后，将滤液分为四层，分别吸取第二层下环中的幼虫和底层幼虫，用生理盐水洗涤离心2次后，再用淋巴细胞分离液重复分离3次，最后收集最底层的脱鞘幼虫。1.2.3不同规格琼脂糖凝胶液的制备用培养的感染期虫卵感染20～25kg重的小猪4只，分别在感染后3d和7d剖杀2只实验猪，取其肝和肺，将肝和肺剪成小块后，用绞肉机绞碎。采用琼脂凝胶法按贝尔曼原理分离幼虫。取9个直径30cm的漏斗，下端连接20cm长的橡皮管，在橡皮管下方接一1.5ml的离心管，剪9块直径30cm的纱布四层分别放入漏斗内，漏斗内装入预热38℃的生理盐水，排出漏斗颈及橡皮管中的气泡。配制0.5%琼脂糖凝胶液，冷却到60℃后，倒入装有生理盐水的漏斗中，使其终浓度约为0.3%～0.4%。分别将绞碎的肝肺平均分装在漏斗中，然后放入40℃温箱中孵育3h，取下橡皮管下的离心管，静置5min，吸去1ml的上层液，留下0.5ml沉淀，用400目分样筛过滤分离肝中的L3，用300目分样筛过滤分离肺中的L3。1.2.4幼虫分离和分离用培养的感染性虫卵感染20～25kg重的小猪3只，在感染后15～18d剖杀实验猪，取其小肠，收集小肠内容物及肠粘膜，按上述收集肺中L3的方法分离幼虫。通过200目分样筛过滤，收集L4。2结果2.1感染l3的制备采用上述次氯酸钠氧化加玻璃珠震荡的方法能收集到大量的脱鞘猪蛔虫感染性L3，且通过淋巴细胞分离液梯度离心后，能获得高纯度的感染性幼虫，且活力较强（图1、2）。2.23和l4观察通过在漏斗内加低浓度的琼脂凝胶的方法获得的猪蛔虫L3及L4纯度很好，且活力较强（图3、4）。3度的研究进展寄生线虫给人和动物带来较为严重的危害，它们在宿主体内的移行会引起一系列的疾病。目前对寄生线虫感染还主要依靠药物治疗，但线虫的抗药性问题日益突出，而且药物治疗还可导致肉类食品中的药物残留及环境污染问题。因此从研究感染期幼虫的特异表达基因着手，可能开辟防制线虫感染的新途径，而体外获得较为纯净的感染期幼虫是开展这些研究的前提。根据FAGERHOLM等的最新研究，猪蛔虫虫卵内的胚胎在卵壳内就已经过2次蜕皮，并发育为具有感染性的L3，这种虫卵感染猪后2～7d内在肝和肺中都没有进行第三次蜕皮，最终是在肠道内才进行第三次蜕皮，发育为L4和成虫，所以寄居在肝和肺中的幼虫都为第三期幼虫（L3），只是大小有所差异。因此，本实验根据FAGERHOLM等的结论，除了体外脱鞘收集虫卵中的感染期L3外，分别从猪肝、肺中收集L3，并在小肠中收集L4进行下一步的实验研究。本实验通过次氯酸钠氧化卵壳，再用玻璃珠震荡，淋巴细胞分离液密度梯度离心去除卵壳的方法能够分离到大量高纯度的感染期幼虫。相对于其它方法，本实验所采用的方法操作简便，分离率高（可达100%），纯度好，为大量制备幼虫提供了快速便捷的方法。有研究认为，次氯酸钠的氧化作用和玻璃珠的机械作用都会导致虫体不同程度的损伤，不利于幼虫的体外培养。但本实验中，次氯酸钠只是氧化卵壳，在卵壳壁被氧化到很薄时，便通过生理盐水的大量冲洗以去除次氯酸钠；接下来的步骤中，幼虫最后是游离在生理盐水的环境中，因此次氯酸钠应该不会对其造成氧化作用的损伤；应比较用这种方法和其它方法收集的幼虫在体外培养中的表现及存活情况，但目前尚未见有关报道。而基于幼虫的个体差异和玻璃珠震荡的均匀度及时间的控制等因素，玻璃珠的机械作用的确会造成虫体不同程度的损伤，但对于幼虫RNA或DNA的制备，它是一种简便快速的方法。采用传统的贝尔曼氏法分离幼虫通常伴随有较多杂质，即使采用不同孔径的分样筛过滤，也难免会有与虫体大小相同的杂质不能被过滤掉，因而不能获得高纯度的幼虫。SLOTVED等和MURRELL等采用终浓度为1%的琼脂凝胶法将含幼虫的碎组织凝固，然后浸泡在0.9%生理盐水中收集幼虫，也能获得纯度较高的幼虫，但获得的虫体数量相对于贝尔曼氏法偏少，这样不利于一次性获得大量虫体，从而增加实验次数和成本。本实验中采用低浓度（0.4%）琼脂凝胶结合贝尔曼氏法分离幼虫的方法，结果显示能够获得大量高纯度的幼虫