中药女贞子的薄层色谱研究

中药女贞子的薄层色谱研究

女贞子是木犀科植物的干燥成熟果实。具有纠正肝肾疾病和明末黑素的功效。它能促进和治疗阴虚、内热、头晕、耳鸣等疾病。现代药理学研究表明,女贞子及其醇或水提取液有调节机体免疫功能、护肝、抗氧化,以及抗炎、抗癌、降血糖的多种作用,因而女贞子是目前抗衰老、抗肿瘤方剂中的主要药物之一,应用十分广泛。《中华人民共和国药典》规定了以薄层色谱法、齐墩果酸为对照品鉴别女贞子药材,并规定齐墩果酸含量不得<0.60%。近年来,陆续发现女贞子中具有重要生理活性的弱脂溶性成分,以对羟基苯乙基-β-D-葡萄糖苷(红景天苷)和多种裂环环烯醚萜苷为代表,且有较高的含量。本研究以齐墩果酸和红景天苷为对照品,分别采用不同的溶剂系统对女贞子进行薄层色谱分析,为更全面地控制药材的质量提供实验依据。红景天苷具有抗氧化、抗缺氧、提高机体对高原缺氧的耐受力等多种作用,其经结构修饰的衍生物可显著提高活性(结果另报)。本研究对这些衍生物的薄层色谱行为进行了考察,以利于更深入的研究。1材料表面1.1zf-i型三用紫外分析方法CS-9000双波长薄层扫描仪(日本岛津公司);ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂);FA-2004型电子天平(上海天平仪器厂)。1.2标准对照品溶液薄层色谱板(硅胶G,10cm×10cm,烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂);女贞子药材(上海市药材公司)由第二军医大学长海医院王忠壮教授鉴定;齐墩果酸标准对照品(中国药品生物制品检定所);红景天苷标准对照品(中国药品生物制品检定所)。以上两种对照品分别配制成约1mg/mL的乙醇溶液,作为标准对照液。红景天苷的衍生物1-(2-羟基苄基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(S2)、1-(3-羟基苯乙基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(S3)、1-苯乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(S1)、1-(4-羟基苯乙基)-β-D-吡喃半乳糖苷(S4),由第二军医大学药学院有机化学教研室和第二军医大学长海医院药学部中药研究室协作合成;氯仿、乙酸乙酯、无水乙醇、环己烷、乙酸、甲醇、甲酸、丙酮等试剂均为分析纯。2方法2.1抗混悬液制备干燥女贞子药材粉碎后称取1g,以乙醇40mL回流提取1h,冷后过滤。滤液蒸干后用50mL水混悬,用氯仿萃取3次,每次15mL,合并氯仿层浓缩至约5mL,为氯仿萃取液。水层再用乙酸乙酯萃取3次,每次15mL,合并乙酸乙酯层浓缩至约5mL,为乙酸乙酯萃取液。2.2环己烷-丙酮-乙酸乙酯,3.2含量测定采用多种色谱条件进行比较,以期能以女贞子脂溶性和弱脂溶性两大类活性成分为基础,获得更全面地鉴别该药材的薄层色谱方法。色谱条件1(a):将氯仿提取液、乙酸乙酯提取液、齐墩果酸对照液和红景天苷对照液同时点样于硅胶G薄层板上,以药典法溶剂系统:环己烷-丙酮-乙酸乙酯(5∶2∶1)为展开剂展开,喷以10%硫酸乙醇液,105℃烘烤5min显色。色谱条件2(b):将以上展开剂改为环己烷-乙酸乙酯-乙酸(5∶2∶1),其他条件不变。色谱条件3(c):将展开剂改为乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶1),其他条件不变。将红景天苷标准对照品和红景天苷的4种衍生物(S1、S2、S3和S4)分别用乙醇溶解并配成0.5mg/mL的溶液,点样于硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-甲醇-乙酸(8∶1∶1)展开,喷以10%硫酸乙醇液,105℃烘烤5min显色。3结果3.1女贞子薄层色谱鉴别女贞子经乙醇提取后,氯仿和乙酸乙酯萃取液不同条件的薄层色谱结果见图1:由A(药典色谱条件)可见,两种萃取液中均有与齐墩果酸对照品相同位置的褐色斑点,Rf值为0.64。而在预实验中,红景天苷对照品在此条件下未能充分展开。而B在显色前,在紫外灯(365nm)下观察,氯仿萃取液有两个强荧光斑点,Rf值分别为0.12和0.52;乙酸乙酯萃取液有1个强荧光斑点,Rf值为0.52。显色后,可见两种萃取液中均有与齐墩果酸对照品相同位置的褐色斑点,Rf值为0.77。预实验中红景天苷也没有展开,但各斑点之间的分离度比A增大,斑点扩散的情况也比A有明显改善。C中齐墩果酸斑点跟着溶剂展开到了前沿,而红景天苷标准对照品的Rf值为0.45。根据以上结果,女贞子的薄层色谱鉴别可分步进行:氯仿萃取液用色谱条件2展开,以齐墩果酸为标准对照品;乙酸乙酯萃取液用色谱条件3展开,以红景天苷为标准对照品。3.2红景天及其衍生物的tcl结果见图2。在该薄层色谱条件下,各斑点均得到满意分离。4红景天苷及其衍生物tlc分离度的初步分析《中华人民共和国药典》2000年版将女贞子用甲醇提取后,以齐墩果酸为标准对照品进行TLC分析,作为女贞子药材的鉴别方法。本研究同时采用齐墩果酸和红景天苷两种化合物作为鉴别指标,兼顾了女贞子脂溶性和弱脂溶性活性成分。除了对照显色后的斑点外,其他相应位置的斑点(如荧光斑点等)也可作为鉴别时的参考。女贞子用乙醇提取后,不直接进行TLC分析,而用氯仿和乙酸乙酯萃取,目的是先行粗分离,而后分别进行TLC分析,尽可能减少干扰,提高分离度。红景天苷和齐墩果酸的极性相差很大,无法使用同一溶剂系统。氯仿萃取液以药典TLC条件展开时,各斑点半径比较大,呈扩散趋势,特别是在齐墩果酸斑点附近,各斑点之间距离接近,分离度不满意。本研究将展开剂改为环己烷-乙酸乙酯-乙酸(5∶2∶1),展开后各斑点半径变小,分离度明显增大。乙酸乙酯萃取液以红景天苷为对照品进行TLC分析时,经多次实验、逐步调整,最后确定展开剂为乙酸乙酯-甲醇-乙酸(8∶1∶1),分离效果较为满意。红景天苷及其衍生物的极性较大,最初曾尝试的展开剂为乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶1),但展开后拖尾严重。适当调整乙酸乙酯和甲醇的比例以增加极性,后又在此展开剂中滴加氨水,以期利用化合物的酸性差异,弱碱性的展开剂将其分开,但结果都不理想。初步分析红景天苷及其4种衍生物的化学结构(见图3),S4为半乳糖苷,半乳糖的2、3位羟基均为a键,且为顺式,因而在5种化合物中极性应最大。S2苯环的碳链上只有1个亚甲基,极性应次之。S3与红景天苷相比,其苯环上的羟基在间位,比酚羟基在对位的红景天苷受烷基的诱导作用弱,使得它的极性略强于红景天苷。S1的苯