棉花立枯病盆栽防治木霉菌的筛选

棉花立枯病盆栽防治木霉菌的筛选

传统的反恐反应检测通常需要分离、盘对比培养和盘对比试验，最后进行现场试验，这需要时间和工作。此外，在线对抗试验的结果往往无法预测蘑菇的抗菌活性。快速可靠的后续过滤技术对预防和控制植物病害非常重要。木霉菌生防菌株的快速筛选,已经发展了凝集素法,但适用范围有限:ITS-1序列分析方法则更适合于特定菌株的识别,而不能作为快速筛选的一般方法。RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNAs)技术自1990年首次被Williams和Welsh用于基因组DNA多态性分析以来,由于具有快速、有效、灵敏度高等特点,而且不受环境条件、发育状况的影响,可以客观地揭示植物、微生物等之间的真实差异。在木霉属的研究中,利用RAPD技术对木霉属菌株进行鉴定和分类是可行的。Tyler认为,分子标记手段特别是其中的RAPD技术,在生防菌的鉴定、差异性分析以及研究生防菌之间的关系是一个很好的方法。本文将尝试将RAPD技术应用于生防木霉菌株的筛选。1材料和方法1.1香港自由基可生物酶基因见表1。其中Tg21,TL31为浙江大学农学院楼兵干老师提供的郁金香致病菌,Tk7a为澳大利亚CSIROLand&WaterM.Ryder博士提供的生物防治菌。其余菌株为本组自不同植物根际分离筛选木霉菌,其中LTR-2是在农业部登记的商品化菌株。1.2棉花消毒和干旱控制参照杨合同方法进行。1.3rapp分析1.3.1r/m振荡培养将各菌株等数目孢子分别接入PDB培养基,28℃150r/m振荡培养。第四天时,分别将发酵液用滤纸过滤,然后放入布氏漏斗用真空泵抽滤,用蒸馏水反复冲洗,直到滤液无色,菌丝按照参考文献以SDS抽提法提取基因组DNA。1.3.2pcr检测taq酶活性290条10bp随机引物购自上海生工,PCR仪为Geneamplifier9600。反应体系为水640μL,10x缓冲液(不含Mg2+)100μL,10xdNTPs20μL,引物80μL,Taq酶10μL,终体积950μL,模板DNA(10～100ng)每管1μL。PCR循环过程为:(1)94℃7min变性,35℃1min退火,72℃延伸1min,1个循环;(2)94℃1min变性,35℃1min退火,72℃延伸1min,44个循环;(3)72℃保温5min。1.3.3遗传距离矩阵的建立取各管产物各3μL,分别与3μL溴酚兰混合均匀,用1%琼脂糖凝胶进行电泳,EB染色,在暗室紫外灯下观察,用富士全色胶卷拍照记录。凝胶图谱以某条带在某样品中出现赋值为“1”和不出现赋值为“0”为依据,计算样品间的距离系数D=1-2(nxy)/(nx+ny)。其中,nxy是两样品间共有的片段总数;nx,ny分别是样本x和样本y的片段总数。根据遗传距离(D),选择不同的引物扩增结果组合用popGen32软件包自动生成距离矩阵和UPGMA(UnweightedPairGroupMethodwithArithmeticMean)聚类图。根据聚类结果,找出适合于生防菌筛选的引物组合,绘出高效生防菌株的特征性条带图谱。2结果与分析2.1花立枯病的防治效果38株木霉菌对棉花立枯病的防治效果见表1。可见所有测定的木霉菌对棉花立枯病都有防治效果。显著性差异测验表明,菌株对棉花立枯病菌的防治效果有显著差异。根据防治效果的高低顺序,可将38个菌株划分为6个组,其中菌株T4,X9,X36,T11和Ag2-1的防治效果为最高。2.2高效木霉菌生防菌株的筛选在所有290条10bp随机引物中,有59条产生多态性扩增条带。每条引物产生的条带最少2条,引物S71,S171产生的条带最多,分别达到14条。条带最小有500bp,最大有2.3kb。经过比较引物产生的多态性条带的特征及异同和聚类分析,发现S1,S42,S60,S122,S146,S147,S171,S180,S181等9条引物产生的共68条多态性条带可以用来筛选高效木霉菌生物防治菌株,9条引物的序列见表2。从图1可以看出,表2中的9条引物能够区分开优秀生防菌株与其它防效较差的木霉菌株。当遗传距离为21.8时,菌株可分为A,B,C,D,E,F等6个组;其中遗传距离为11.3时,A组可分为A1,A2两个亚组,当遗传距离为19.4时,D组可分为D1,D2两个亚组,A2,D2两个亚组分别只含防效1级的菌株X9,X36以及T4,T11,Ag2-1。菌株X9,X36聚在Al组,T4,T11,A2-1聚在A3组,显示了它们有比较近的遗传距离,与其它生防效果差的菌株有不同的组别。Tk7a是澳大利亚研究很充分的菌株,在小麦病害的防治、蔬菜病害的防治上表现良好,而LTR-2于1997年在我国农业部登记注册为新农药,虽然这两个菌株不属于同一个种,但明显聚类为一个组。这说明表2中的9条引物在RAPD方法中用于木霉菌生防菌株的初步筛选是可行的。图2是5条引物对高效菌株T4,T11,Ag2-1和X9,X36的扩增模式图,在利用该组引物进行菌株的RAPD筛选时,可作为参考。3木霉菌属中生防功能的核心基因检测高效木霉菌类生物防治菌的筛选技术,是限制木霉菌开发的重要障碍,研究简单、快捷、准确的生物防治菌筛选技术是一个重要而紧迫的课题。RAPD技术是DNA指纹技术的一种,可用于把具有同一性状的个体按遗传距离的远近聚类到一起。本研究把各木霉菌株防治棉花立枯病菌的能力高低作为指示性状,尝试发展木霉菌生防菌株的RAPD筛选技术,结果发现有9条引物对可用于该目的。据此初步建立了木霉菌高效菌株的RAPD筛选技术。Zimand用一套引物将优秀生防木霉菌株T-39从其它低生防能力的木霉菌株中区别开来;Ospina-Giraldo等根据rDNA的ITS序列能够把对蘑菇致病的和有植病生防功能的木霉菌区别开;Grondona等结合生理生化特性研究了木霉菌的ITS序列与生物防治活性的关系,发现菌株的生防活性取决于防治对象和防治活性有关的功能;Schlick等用微卫星和ITS序列测定技术建立了哈茨木霉菌突变株和专利菌株的识别技术。本研究表明,RAPD扩增结果在高效菌株间是相似或相同的,高效木霉菌生物防治菌株存在至少部分相似或相同的与生物防治功能有关的普遍性遗传基础,在此基础上能够发展具有普遍应用价值的以DNA指纹分析为基础的分子筛选技术,甚至克隆现在还不了解的植病生防功能基因。这说明RAPD技术不但能够满足菌株识别的需要,在合理使用的前提下,也能够用于高效菌株的筛选。本研究仅利用木霉菌防治棉花立枯病的防治效果作为挑选RAPD随机引物的指示形状,因此所采用的引物是否能够用来筛选防治其