不同滤纸对龈沟液收集的影响

不同滤纸对龈沟液收集的影响

牙龈出血（tcf）是牙龈组织的渗出物。它的成分来自血清和牙龈组织的局部。近年来,对于龈沟液的研究除了其分泌量以及各成分的变化与牙周炎症的相关性之外,越来越多地涉及口腔正畸、口腔修复、口腔种植及其与系统性疾病的相互关系等方面。Page认为,龈沟液作为检测患者牙周病易感程度的主要研究样本之一最具潜力。Javed等指出,对种植体周围龈沟液(peri-implantcrevicularfluid,PICF)中细胞因子水平的监测,有助于检测尚未出现临床症状的早期炎症。龈沟液采集是对龈沟液进行相关研究的基础。龈沟液采集方法一般有龈沟液冲洗法、微吸管法和滤纸条法,其中,以滤纸条法最为常用。龈沟液的定量方法有茚三酮染色法、称重法、检测龈沟液在滤纸条上的迁移距离和使用龈沟液测量仪(Periotron)。其中,使用龈沟液测量仪最为精确方便,但其价格昂贵且检测范围小,如Periotron8000检测的理想范围为0.1~1.2μL,这些都限制了Periotron在临床上的应用。目前,我国多采用自制滤纸条采集龈沟液样本[2,3,4,5,12,13,14,15]。本研究通过体外实验,对whatman3MM层析滤纸和whatman3#定性滤纸在收集龈沟液及蛋白萃取等方面进行比较,为临床研究中选用合适滤纸采集龈沟液提供实验依据。1材料和方法1.1蛋白浓度测定whatman3MM层析滤纸(Whatman,英国);whatman3#定性滤纸(Whatman,英国);正常人血清;0.9%NaCl溶液(上海长征富民金山制药有限公司,中国);品红溶液;0.5mLEp管(Axygen,美国);BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天生物技术研究所,中国);0.1~2.5μL、2~20μL、20~200μL和100~1000μL量程的微量加样器(Eppendorf,德国);96孔板(Corning,美国);Zeiss立体显微镜(Zeiss,德国);WH-1微型漩涡混合仪(金坛市盛蓝仪器制造有限公司,中国);TOMOSMiniStar微型迷你离心机(上海托莫斯科学仪器有限公司,中国);恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司,中国);BioRad2550自动酶标仪(Bio-Rad,美国)。1.2方法1.2.1滤纸的制备将whatman3MM层析滤纸和whatman3#定性滤纸裁成2mm×8mm大小的滤纸条,置于干净容器中备用。whatman3MM层析滤纸设为A组,whatman3#定性滤纸设为B组。1.2.2血清品红溶液添加量观察在正常人血清中滴入少量品红溶液,使其染色便于观察。使用微量加样器,在各组15个样本上依次加入0.1~1.5μL血清品红溶液(0.1μL依次递增)。Zeiss立体显微镜下观察,SPOT4.6软件拍照、测量每张滤纸条上溶液浸润长度,重复4次。计算获得浸润长度与溶液体积的相关性,并比较2种滤纸的差异。1.2.3血清中pacl的浓度使用微量加样器在A、B组滤纸条上分别依次加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5μL正常人血清。同体积重复5次。将各滤纸条分别浸于盛有200μL0.9%NaCl溶液的Ep管中,静置30min。震荡5min,离心1min。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定各萃取液的总蛋白浓度,比较2组差异。1.2.4血清萃取及蛋白浓度测定用0.9%NaCl溶液将正常人血清等倍稀释,获得5个不同浓度(C16、C/8、C/4、C/2、C)的血清溶液。使用微量加样器在A、B组滤纸条上分别依次加入5种浓度的血清溶液1μL。同浓度重复5次。萃取及蛋白浓度测定方法同1.2.3。比较2组差异。1.3统计学分析实验数据以x±s表示,采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。溶液浸润长度与溶液体积的关系采用线性回归分析,2组差异采用方差分析,P<0.05为差异具有显著性。2结果2.1滤纸条中溶液浸渍长度与溶液体积相关性分析A、B2组溶液浸润长度与溶液体积的拟合曲线见图1、2。图1中,R2=0.995,图2中,R2=0.995,表明A、B2组滤纸条中溶液浸润长度与溶液体积均呈良好的线性关系。表1为A、B2组滤纸条中溶液浸润长度与溶液体积相关性的比较。溶液体积为0.1μL时,溶液平均浸润长度A<B,其余各体积均A>B。经方差分析,2组溶液浸润长度有显著差异(P<0.05)。2.2蛋白萃取性能测定表2为相同浓度、不同体积正常人血清A、B2组滤纸条的蛋白萃取性能比较结果。经方差分析,A、B2组的萃取液总蛋白浓度无显著差异(P>0.05)。2.3滤纸条的萃取性能测定表3为相同体积、不同浓度正常人血清A、B2组滤纸条的蛋白萃取性能比较结果。经方差分析,A、B2组的萃取液总蛋白浓度差异无统计学意义(P>0.05)。3滤纸条的蛋白回收性能测定已发现龈沟液含有几十种成分,目前,对于龈沟液的研究包括口腔修复学、牙周病学、口腔正畸学、口腔种植学及其与系统性疾病的相互关系等多个领域。国内在对龈沟液的研究中,多使用沟内法采集龈沟液,但所选用的滤纸种类不一,常见的有whatman1#定性滤纸、whatman3#定性滤纸、whatman3MM层析滤纸等。究竟哪种滤纸在采集龈沟液方面性能更优,研究中选用哪种滤纸均需要实验依据。陈智滨等通过比较吸潮纸尖与传统滤纸条采集龈沟液样本质和量的差异,认为吸潮纸尖可以替代传统手工裁剪的滤纸条。但目前国内外众多对于龈沟液的研究中,使用滤纸作为采样材料仍为主流。Griffiths等对periopaper(Harco)、whatman1#层析滤纸、whatman4#层析滤纸和whatman3MM层析滤纸4种滤纸进行比较,认为2mm×8mm大小的whatman3MM层析滤纸条对血清蛋白的回收率最高。Johnson等对whatman1#滤纸、whatman3MM层析滤纸、periopaper(ProFlow)和periopaper(Harco)4种滤纸条蛋白回收性能进行比较,认为不同滤纸条对蛋白的洗提和回收的效率不同,whatman滤纸优于periopaper滤纸,并指出早先各研究小组间实验数据的差异可能与GCF蛋白从滤纸条上不完全洗提有关,而这种不完全洗提归因于蛋白在滤纸条上的黏附和滤纸条对蛋白的截留。本研究中,A组whatman3MM层析滤纸和B组whatman3#定性滤纸的溶液浸润长度与溶液体积均呈现良好的线性关系,表明可采用龈沟液在滤纸条上的迁移距离来对所采集的龈沟液进行定量。2组溶液浸润长度的差异具有统计学意义,除体积为0.1μL时,A组滤纸条上的溶液浸润长度均大于B组,表明相同大小的2种滤纸条,whatman3#定性滤纸所收集的龈沟液量大于whatman3MM层析滤纸。根据Whatman公司产品介绍中所给出的数据,A的厚度为0.34mm,B的厚度为0.39mm。因此,理论上,相同大小的2种滤纸条所收集的龈沟液量B大于A,与实验结果相符。可以认为,当龈沟液分泌量较大,相同时间内所采集的龈沟液样本较多,如牙周炎症较重时,选用whatman3#定性滤纸优于whatman3MM层析滤纸。个体的龈沟液总蛋白浓度不同,且单位时间内龈沟液的分泌量也不同,又因龈沟液是血清的渗出液,因此,本实验采用相同浓度不同体积以及相同体积不同浓度的正常人血清溶液对A、B2种滤纸的蛋白萃取性能进行比较。结果显示,2组的萃取液总蛋白浓度无显著差异。这可能与2种滤纸的颗粒保留孔径大小相近,对蛋白的截留性能接近有关。蛋白质的黏附特性随滤纸种类的不同而有所差别,滤纸的蛋白萃取效率与滤纸的种类及蛋白的浓度密切相关。本实验A、B2组所使用的蛋白溶液相同,为同一正常人血清或血清溶液,且根据Whatman公司产品介绍,两者均为纤维素类滤纸。因此,whatman3MM层析滤纸和whatman3#定性滤纸对相同蛋白溶液的萃取效率无显著差别。综上所述,whatman3MM层析滤